英文原题：
Hormetic effect of pyroligneous acids on conjugative transfer of plasmid-mediated multi-antibiotic resistance genes within bacterial genus
通讯作者：郑浩，中国海洋大学；邢宝山，美国麻省大学
作者：Mengying Shao, Liuqingqing Liu, Bingjie Liu, Hao Zheng, Wei Meng, Yifan Liu, Xiao Zhang, Xiaohan Ma, Cuizhu Sun, Xianxiang Luo, Fengmin Li, Baoshan Xing
内容简介
中国海洋大学郑浩教授课题组与美国麻省大学阿默斯特分校邢宝山教授揭示了多功能土壤改良剂木醋液（pyroligneous acids，PA）对抗生素抗性基因（ARGs）接合转移的 Hormesis 效应和机制（即低剂量促进但高剂量抑制），为基于 PA 的土壤 ARG 污染阻控技术的建立提供了理论依据，强调了土壤改良剂施用剂量不当而促进 ARGs 传播扩散的潜在风险。
摘要
文章解读
抗生素滥用导致的细菌耐药性已成为21世纪威胁人类健康和生态环境安全的重大挑战。粪肥施用、污水灌溉、污泥施肥和垃圾填埋等人类活动导致大量的抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）进入土壤，使得农业土壤成为ARGs的重要储存库。富集于土壤中的ARGs可通过食物链进入人体，进一步加剧抗生素耐药性对人类健康的威胁。因此，有效削减土壤ARGs污染对缓解抗生素耐药性在全球范围内传播并保障全球生态系统健康具有重要意义。除生物炭（biochar）外，生物质热解产物木醋液（pyroligneous acids，PA）作为一种多功能土壤改良剂，可降低土壤盐分和 pH，调节细菌群落，灭活植物病原菌，促进作物生长并提高粮食产量。课题组前期研究发现，无论是 PA 单独施用，还是与生物炭联合施用，均可通过抑制基因水平转移（HGT）、降低重金属共选择压力、调节微生物群落等途径有效降低土壤 ARGs 丰度，且 PA 对 HGT 的抑制是 ARGs 减少的主要原因。然而，PA 对 HGT 过程的影响机制尚不明确，限制了基于PA的土壤 ARG 污染修复技术的发展。ARGs 可通过 HGT 在同种属或不同种属微生物间进行传递，致使更多的微生物产生抗性，是微生物适应抗生素胁迫的主要分子机制。接合转移指供受体细菌通过膜孔或菌毛相互连接形成通道，使携带ARGs的遗传物质借助质粒、插入序列和转座子等可移动遗传元件（MGEs）在同种属或不同种属个体之间传播扩散的过程，是 HGT 的主要途径。细菌间的接合转移过程对外部环境条件十分敏感，抗生素（如头孢噻肟、氨苄西林和环丙沙星）和非抗生素化学品（如防腐剂、消毒剂和甜味剂）在亚抑制水平，即低于最小抑菌浓度（MIC），均可通过诱导活性氧（ROS）的过量产生和增加细胞膜通透性等促进 ARGs 接合转移，增加 ARGs 污染风险，而高于 MIC 时导致细菌死亡，通常会抑制 ARGs 的接合转移。PA含有有机酸、酚类、酯类、醛类和醇类等多种水溶性化合物，对细菌、真菌、植物病原体和病毒具有很强的抗菌活性。但是，PA 对 ARGs 接合转移影响机制的研究尚未见报道。
因此，本研究以携带 RP4 抗性质粒的大肠杆菌 HB101 为供体菌、大肠杆菌 NK5449 为受体菌构建接合转移模型，以废弃木材为原料于450°C下热解制备木醋液原液（PA）为代表，利用平板计数法评估了 PA 对 RP4 质粒介导的 ARGs 在大肠杆菌种内接合转移影响的剂量效应关系（图1）。为进一步明确 PA 的关键成分及 pH 对 PA 影响 ARGs 接合转移的作用，选择98、130和220°C下 PA 的三种精馏组分（F1、F2和F3）以及乙酸、2-甲氧基苯酚、2,6-二甲氧基酚和3-甲基-1,2-环戊二酮四种关键代表性成分，并通过调节接合体系的pH，探究了其对 ARGs 接合转移的影响（图1）。最后，通过探究细菌活性、ROS 产生、细胞膜透性、表面形貌、胞外聚合物（EPS）分泌及表面电荷变化，揭示了 PA 调控 ARGs 接合转移的分子机制（图1）。
本研究将为基于 PA 的土壤 ARG 污染阻控技术的建立提供新的科学见解。
图1. 供试材料及实验设计示意图
PA 对 RP4 质粒在大肠杆菌间的接合转移具有 Hormesis 效应：
为评估 PA 对 RP4 质粒介导的 ARGs 接合转移的剂量效应关系，利用平板计数法测定了接合子数量和接合转移频率（图2）。与对照组相比，较高剂量的 PA（40~100 μL）使接合子数量显著降低了74~85%（图2a），抑制了 RP4 质粒的接合转移。然而，60~100 μL 的剂量下接合转移频率却较空白对照显著提高了30~45%（图2b）。这主要归因于 PA 导致受体细菌数量减少（86~90%）的程度大于接合子（78~85%）(图2a，c)。然而，较低剂量（10和20 μL）的PA使接合子数量和接合转移频率显著增加了26~47%和114~234%（图2a，b），明显促进了 RP4 质粒的接合转移。这些结果证实了 PA 对 ARGs 在细菌种属内的接合转移具有 Hormesis 效应，即低剂量促进但高剂量抑制。
图2.不同剂量的木醋液 PA 对 RP4 质粒在大肠杆菌间接合转移的影响:（a）接合子数量；（b）接合转移频率；（c）受体菌数量；（d）供体菌数量
PA 的关键组分对接合转移的影响：
为明确 PA 的化学组分对PA影响 RP4 质粒接合转移的作用，首先探究了 PA 的三种精馏组分（F1、F2和F3）对 ARGs 接合转移的影响（图3）。与 PA 相似，三种精馏组分对 RP4 质粒接合转移也表现出了类似的 Hormesis效应（图3a，b）。尤其是较高剂量的 F3（40 μL）使接合子数量减少了49%，而较低剂量（10和20 μL）下接合子数量增加了25~63%。另外，PA 及其组分对接合转移作用的 Hormesis 效应程度 PA > F3 ≈ F2 > F1（图3）。这些结果与课题组前期的研究结果一致，即PA及其精馏组分有效降低了土壤中 ARGs 的丰度，这进一步证实了 PA 通过抑制 HGT 过程来削减土壤 ARGs 污染的可行性。
图3.PA 及其三种精馏组分对 RP4 质粒在大肠杆菌间接合转移的影响:（a）接合子数量；（b）接合转移频率；（c）受体菌数量；（d）供体菌数量
PA 及精馏组分具有不同含量的酸类、酚类和酮类等化学物质，这可能导致其对接合转移的影响程度不同。为进一步明确 PA 中影响 ARGs 接合转移的具体组分，根据其化学组成，探究了乙酸、2-甲氧基酚、2,6 -二甲氧基苯酚和3-甲基- 1,2 -环戊二酮四种具有抗菌和抗氧化性能的代表性组分对RP4接合转移的影响（图4）。与 PA 及其三种精馏组分相似，和对照组相比，PA 的四种关键成分在亚抑制浓度下（即乙酸和2-甲氧基苯酚浓度为0.001 mg/mL，2,6 -二甲氧基苯酚浓度为0.1 mg/mL，3-甲基- 1,2 -环戊二酮为0.05 mg/mL）分别使接合子数量增加了39%、49%、12%和24%（图4），促进程度为乙酸 ≈ 2-甲氧基酚 > 2,6 -二甲氧基苯酚 ≈ 3-甲基- 1,2 -环戊二酮。相反地，当这四种物质的浓度高于MIC时（即乙酸浓度为0.1 mg/mL，2-甲氧基苯酚浓度为1 mg/mL，2,6 -二甲氧基苯酚浓度为2 mg/mL，3-甲基- 1,2 -环戊二酮为3 mg/mL），接合子数量均显著减少，且降低程度为乙酸 ≈ 2,6 -二甲氧基苯酚 > 3-甲基- 1,2 -环戊二酮 > 2-甲氧基苯酚（图4）。可见，PA 的这四种关键成分对 RP4 质粒接合转移也具有与 PA 相似的 Hormesis 效应，这就证实了 PA 中的酸类、酚类和醇类等化合物是其导致 ARGs 接合转移剂量效应的关键因素。
图4.PA 的四种关键成分对接合子数量和 RP4 质粒在大肠杆菌间接合转移频率的影响:（a, b）乙酸；（c, d）乙酸、2-甲氧基苯酚；（e, f）2,6-二甲氧基酚；（g, h）3-甲基-1,2-环戊二酮
酸性 PA 降低了接合体系的 pH 从而抑制了 RP4 质粒在大肠杆菌间的接合转移：
ARGs 接合转移过程对外界环境条件（如pH、温度、湿度和盐度等）十分敏感。PA 中的乙酸和2-甲氧基苯酚等酸性成分使 PA 的 pH 往往呈酸性（≤ 2.81），这导致 PA 添加下的接合体系呈酸性（pH 5.45~6.75）。为探究 PA 的 pH 对 RP4 质粒接合转移的影响，本研究进一步设置了空白组（CK，不添加 PA 且不调节 pH）、pH 对照组（unadjusted pH，添加 PA 且不调节 pH）、pH 调节组（adjusted pH，添加 PA 且将接合体系 pH 调为7.0）与无 PA 处理组（no PA，不添加 PA 并将接合体系 pH 调节为与添加 PA 时一致），进行了同样的接合转移实验。结果表明，添加较高剂量（40 μL）的PA或精馏组分时，与 pH 对照组（pH 5.45~6.45）相比，pH 调节组的接合子数量和接合转移频率显著增加；与空白组相比，无 PA 组（pH 5.45~6.45）的接合子数量和接合转移频率分别下降了30~52%和12~39%（图5a，b)。另外，添加较低剂量（20 μL）的 PA 或精馏组分时，无 PA 组（pH 6.07~6.75）的接合子数量和接合转移频率与空白组相比，分别降低了32~66%和10~67%（图5c，d）。综上所述，这些结果证明了无论高剂量或低剂量的酸性 PA 所导致的接合体系pH的降低，均抑制了 RP4 质粒在大肠杆菌间的接合转移。
值得注意的是，尽管 pH 调节组的与空白组的 pH 均为7.0，但高剂量 PA 下 pH 调节组的接合子数量仍低于空白组（图5a，b），低剂量 PA 下 pH 调节组的接合子数量仍高于空白组（图5c，d）。这些结果进一步表明了除了 PA 导致的接合体系 pH 降低外，PA 的关键组分也是影响接合的重要原因。以往研究发现多种有毒有机化合物（如麦草畏、对氨基苯酚和苯酚）在低于 MIC 水平下，可通过增加胞内 ROS、细胞膜透性和细胞间的接触促进 ARGs 接合转移，而高于 MIC 水平的这些化合物则可通过抑菌作用抑制 ARGs 的接合转移。因此，我们推断同样具有抑菌作用且含有大量酚类的 PA 对 RP4 质粒的接合转移也可能有相似作用机制，这些机制将在下面进一步讨论。
图5. PA 酸性对 RP4 质粒在大肠杆菌间接合转移的影响:
（a，b）高剂量 PA 暴露下的接合子数量和接合转移频率；（c，d）低剂量 PA 暴露下的接合子数量和接合转移频率
PA 增加了细菌胞内ROS的产生：外界环境胁迫诱导细菌细胞产生的活性氧（•O2–、•OH 和 H2O2）可刺激氧化应激，破坏生物分子（如 DNA、膜蛋白和脂质），激活 SOS 反应，甚至导致细胞死亡，从而影响 ARGs 接合转移。PA 及其精馏组分导致供受体大肠杆菌胞内 ROS 水平呈剂量依赖性增加，且增加程度顺序为 PA > F3 > F2 > F1（图6a），这与它们对接合转移的促进或抑制作用基本一致（图3a，b）。低剂量的 PA 及其组分通过促进胞内 ROS 的产生，诱导氧化应激和 SOS 应答，促进了 RP4 质粒在大肠杆菌间的接合转移。尽管 PA 及其组分在高剂量时比低剂量诱导的 ROS 水平更高（图6a），但由于过高水平的 ROS 往往导致细菌细胞死亡（图3c，d），从而抑制了 RP4 质粒的接合转移。为了进一步确定所观察到的 ROS 增加是否与属内接合转移有关，探究了 ROS 清除剂谷胱甘肽（GSH）的添加对接合转移的影响。结果表明，相对于不添加 GSH 组，添加 GSH 组的接合转移频率与不添加 PA 的空白对照组相比无显著差异（图6b），证实了 PA 及其组分诱导的 ROS 产生是其促进接合转移的关键因素。
图6.PA 及其精馏组分对细菌胞内 ROS 产生、细胞膜透性及细菌间接触的影响:（a）ROS产生；（b）GSH添加对接合转移的影响；（c）TEM图像；（d）腐细胞膜透性；（e）PN/PS及细菌表面Zeta电位
PA 增加了供受体细菌细胞膜透性：
细菌细胞膜是阻止胞外化学物质和基因自由进入细胞的重要屏障。ROS 可与细胞膜上的不饱和脂肪酸发生反应，引起脂质过氧化，导致细胞膜通透性增强。通过TEM图像观察，未处理组大肠杆菌胞结构正常，细胞膜完整，表面光滑，胞浆致密，细胞分散，物理接触有限（图6c）。然而，低剂量（10和20 μL）PA处理组中，细胞细胞膜明显损伤，导致膜孔产生，细胞边界模糊，菌毛断裂，细胞与细胞之间的接触增强（图6c），这些现象均有利于 ARGs 接合的发生。利用流式细胞仪进一步定量了 PA 对大肠杆菌细胞膜通透性的影响（图6d），发现细胞膜通透性随 PA 及其精馏组分剂量的增加而增加，且促进程度为 PA > F3 > F2 >F1（图6d），与促进接合转移的作用相一致（图3a，b），证实了低剂量 PA 通过增加细胞膜透性促进了 ARGs 接合转移。然而，高剂量 PA 使细菌细胞完全灭活，细胞膜完全破裂，这也是 TEM 图中细胞膜损伤更严重、细胞质萎缩或渗漏的原因，进一步表明了高剂量 PA 导致细胞膜严重受损使细菌失活，从而抑制了 ARGs 接合转移（图6c）。
PA 增加了供受体细菌间的物理接触：
有效的细胞间接触是 ARGs 接合转移成功的关键。EPS主要由蛋白质、多糖、胞外DNA和脂类组成，其通过促进细胞间接触在生物膜形成和细菌基因转移中发挥重要作用。EPS 的产生受 ROS 的信号调节。PA 及其组分一方面增加了 EPS 中蛋白质与多糖（PN/PS）的比例，增强了细胞表面疏水性，另一方面降低了细菌表面负电荷，减弱了细菌细胞间的静电斥力，更有利于细菌间的接触，为 RP4 质粒的传播提供了便利（图6e）。此外，Pearson 相关分析结果表明，细菌胞内 ROS 产生、细胞膜透性及 EPS 的产生均与 PA 的乙酸，2-甲氧基苯酚，2，6-二甲氧基苯酚和3-甲基-1，2-环戊二酮四种关键成分含量呈正相关，进一步证实了 PA 中的酸类、酚类和酮类等代表性的化学组分诱导的非致死胁迫效应是其促进 ARGs 接合转移的主要原因。
图7. PA 对 RP4 质粒在大肠杆菌间接合转移影响的潜在机制示意图
结论和现实意义：
该工作首次评估了多功能土壤改良剂 PA 对细菌属内质粒介导的多重耐药基因接合转移的 Hormesis 效应（低剂量促进但高剂量抑制），并从分子水平上明确了 PA 调控 ARGs 接合转移的机制。较高剂量（40~100 μL）的 PA 抑制 RP4 质粒在大肠杆菌属内接合的主要原因是：（1）受体和供体生长受到抑制；（2）抗氧化系统的破坏；（3）细胞膜受损；（4）菌毛断裂（图7）。这种抑制作用主要是由于 PA 的抗菌成分（乙酸、2-甲氧基苯酚、2,6 -二甲氧基苯酚和3-甲基- 1,2 -环戊二酮）以及PA的酸性（pH ≤ 2.81）共同导致。较低剂量（10~20 μL）的 PA 促进接合的主要原因包括：（1）胞内 ROS 生成增加；（2）细胞膜通透性增强；（3）EPS 含量增加；（4）细菌表面电荷减少（图7）。这种促进作用主要归因于 PA 的关键化学成分诱导的细菌非致死胁迫效应。该研究为基于 PA 的土壤 ARG 污染阻控技术的建立提供了新的科学见解，并为土壤改良剂 PA 的合理施用提供了切实证据。基于 PA 对 ARGs 接合转移的 Hormesis 效应，本研究结果强调了优化土壤改良剂施用剂量以通过抑制 ARGs 的水平转移削减土壤 ARGs 污染的必要性。此外，PA 低剂量下对 ARGs 接合转移的促进作用也引发了人们对 PA 和其他具有抗菌活性的土壤改良剂（如腐殖酸和木质素）不当施用而通过增强水平基因转移促进土壤中ARGs传播扩散的环境风险的担忧。
该项研究得到了Hainan Provincial Joint Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City (220LH061)，Hainan Provincial Key Research and Development Projects (ZDYF2022SHFZ018)，National Natural Science Foundation of China (42077115)，National Science Fund for Distinguished Young Scholars of Shandong Province (ZR2021JQ13)项目的支持。研究的相关结果已发表于ACS Environmental Au。
思考与启示
PA 作为多功能土壤改良剂可有效修复土壤中 ARGs 污染，然而目前关于 PA 对 ARGs 接合转移的影响机制仍不明确，限制了基于 PA 的土壤 ARGs 污染修复技术的发展。本研究聚焦于 PA 削减 ARGs 污染过程中如何影响其接合转移这一关键科学问题，明确了 PA 对 RP4 质粒介导的多重耐药基因在大肠杆菌 HB101 和 NK5449 之间的接合转移具有 Hormesis 效应（即低剂量促进但高剂量抑制），揭示了 PA 在高剂量下由于其抑菌性抑制了 RP4 质粒接合转移的发生，而低剂量下通过诱导细胞内活性氧的产生、促进细胞膜通透性及增加细胞间接触，促进了RP4质粒的接合转移。本研究为基于 PA 的土壤 ARGs 污染阻控技术的建立提供了理论依据，同时也强调了土壤改良剂施用剂量不当时促进 ARGs 传播的潜在风险。
鉴于 PA 的代表性组分（如酸类、酚类和酮类）对接合转移具有关键作用，未来可通过选择合适的原料和蒸馏工艺优化 PA 的抑菌性能，以提高 PA 对土壤 ARGs 污染的修复效果。此外，我们发现 PA 在低剂量下通过增加 ROS 的产生、细胞膜透性和 EPS 的生产促进了 ARGs 接合转移，因此 PA 与一些抗氧化剂（如谷胱甘肽和硫脲）或 EPS 清除剂（如金属基纳米材料和群感信号分子抑制酶）联用可能有助于克服 PA 施加量不当时导致的 ARGs 传播风险。然而，本研究仅选用了一种木材废弃物制备的 PA，且利用实验室纯菌培养模型来探究其对大肠杆菌种内细菌间 ARGs 接合转移的影响，但 PA 的原料和多样化的制备工艺往往导致其组成和性质差异较大，其对 ARGs 的接合转移或其他水平转移过程（如转化和转导）的影响，尤其是实际土壤生态系统的微生物群落之间 ARGs 水平转移的影响可能也存在较大差异，未来仍值得进一步探究。
感谢中国海洋大学郑浩教授撰写本文中文解读！
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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