《自然—植物》：南方科技大学杜嘉木团队成功解析ROS1和DNA底物复合物结构

ROS1/DEMETER家族蛋白作为DNA去甲基化酶，其作用机制研究一直是该领域的核心问题。近日，南方科技大学杜嘉木教授课题组成功解析了ROS1和DNA底物复合物的结构。

北京时间2023年1月10日凌晨0时，Nature Plants在线发表了这一成果。南方科技大学杜嘉木教授为该文的通讯作者，该课题组高级研究学者（现深圳大学博士后）杜璇博士为第一作者。

真核生物中，DNA的甲基化修饰（5mC）广泛存在于基因组中，包括基因重复序列、外显子以及内含子。基因组内特定的甲基化水平则是由甲基化的建立、维持以及去除作用来共同维持，使其处于动态的平衡状态。因此，DNA的去甲基化作用在调控基因激活和沉默，以及防止过度甲基化而造成的基因沉默过程中是必不可少的。

在动物的DNA的去甲基化过程中，5mC依次被TET氧化并由TDG进行碱基切除，最终由DNA损伤修复通路介导转化为正常的胞嘧啶。与之不同的是，植物则利用ROS1/DEMETER家族DNA Glycosylase/lyase双功能酶直接识别并依次切除碱基和脱氧核糖，产生DNA单链缺口，并由DNA修复系统介导胞嘧啶的修复完成DNA去甲基化，是一种更为简单高效的DNA去甲基化机制。

2002年ROS1首次被鉴定为植物的DNA去甲基化酶，并由朱健康院士和巩志忠教授发表在《细胞》上。从那之后近20年，关于ROS1/ DEMETER家族蛋白的功能研究不断被报道，然而由于该类酶富含无规卷曲、底物亲和力弱等一系列特征，导致其相关的分子机制研究进展缓慢。

在杜嘉木教授的指导下，研究人员对ROS1开展了大量的蛋白改造，包括其N-端以及内部所含的长的无序区域进行截短、引入了活性位点D971N突变以及将人源转录因子SRY与ROS1融合表达等，经过大量的尝试之后成功获取了具备活性而又极大缩减无序区的片，并在抑制酶活的基础上增强了酶与DNA的亲和力，通过多年来的不懈探索和尝试，最终解析得到的ROS1与5mC-dsDNA复合物3.1Å高分辨率冷冻电镜结构。

与其他物种中DNA Glycosylase/lyase不同的是，ROS1除了具有经典的DNA glycosylase结构域以外，其C端包含一个植物特有的BAH结构域，他们共同参与了对5mC碱基的识别。从结构中可以看到，双链DNA以5mC为中心弯折了60°，翻转出来的碱基与ROS1之间产生一系列疏水和氢键的相互作用，是ROS1对底物特异性识别的机制，后续的基于点突变的酶活实验也对其进行了佐证。

在此基础上，研究人员进一步解析了ROS1与包含T/G 错配的双链DNA底物的复合物结构，并指出由于碱基T的N3位拥有一个质子，因此不能与H1027的NE2之间形成氢键相互作用，导致ROS1对含有T/G错配的DNA底物的活性降低（对比于5mC-dsDNA）。同时，研究人员进一步分析了ROS1对不同种类碱基作为底物的活性增强或减弱的具体分子机制。除此之外，研究人员捕捉到了ROS1在碱基去除过程中的中间产物状态，并指出K953在该过程中起到了重要作用。

通过该研究，阐明了植物特有的ROS1家族作为DNA去甲基化酶在底物识别和碱基去除过程中重要的分子作用机制，为后续基于ROS1作用原理的DNA去甲基化基因编辑工具的开发提供了参考。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41477-022-01322-8

转自：“小柯生命”微信公众号

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