投稿问答最小化  关闭

万维书刊APP下载

甘肃中医药大学:基于mTOR/HIF-1α/VEGF通路研究红芪多糖防治放射性肺损伤的作用机制

2022/12/1 15:37:44  阅读:205 发布者:

放射性肺损伤(radiation-induced lung injuryRILI)包括前期放射性肺炎及后期放射性肺纤维化,是胸部放疗最常见的剂量限制性并发症[1]。由于RILI有许多促成因素和诊断环境,其报告的发病率差异显著,数据显示,RILI发病率最高的是肺癌(5%25%),其次是纵隔淋巴瘤(5%10%)和乳腺癌(1%5%[2]RILI的发生不仅限制了放疗的最高剂量,降低了肿瘤的控制率,而且可导致呼吸困难等症状,影响患者生活质量,甚至后期可进展为呼吸衰竭,威胁患者生命。目前RILI的发病机制尚未完全阐明,国内外尚无针对RILI的特效药[3]。吡非尼酮是美国胸科学会/欧洲呼吸学会/日本呼吸学会/拉丁美洲胸科学会(ATS/ERS/JRS/ALAT2022年更新的临床实践指南中,推荐用于治疗特发性肺纤维化的药物之一,具有抗炎、抗氧化和抗纤维化等特性[4-6],可用于治疗RILI。然而,长期应用吡非尼酮可能会使患者出现胃肠道症状、皮肤不良反应以及肝功能损伤等不良反应,在美国的一项III期临床试验中,14.4%的患者因为其不良反应不得不停止用药[7]。近年来,中医药在干预RILI的发生发展上取得了较好的疗效[8-9],因此,研究中医药防治RILI并探索其作用机制具有重要临床意义。

红芪多糖是甘肃省道地药材红芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.中提取出的主要活性物质,具有抗炎、抗氧化、机体保护、免疫调节等多种药理作用[10-14]。此外,文献报道红芪多糖对内毒素诱导的急性肺损伤具有保护作用[15]。本课题组前期研究发现,红芪多糖可以明显改善博来霉素诱导的肺间质纤维化[16-17],而红芪多糖是否可以改善RILI目前尚未见报道。基于此,本研究建立RILI小鼠模型,通过小鼠肺功能检测、CT影像学检测、组织病理学检测等手段初步探讨红芪多糖对RILI的防治作用及机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级雌性C57BL/6J小鼠56只,68周龄,体质量(20±2g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,实验动物质量合格证号SCXK(京)2019-0010,实验动物设施使用证号SYXK(甘)2020-0009。动物饲养于甘肃中医药大学实验动物中心,室温(23±2)℃,相对湿度40%52%12 h光照/ 12 h黑暗交替,动物自由进食饮水。动物实验经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准(批准号2021-241)。

1.2 药材

红芪饮片购自甘肃省陇南市安化镇,经甘肃省药品检验研究院马潇主任药师鉴定为豆科植物多序岩黄芪H. polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根,符合《中国药典》2020年版规定。

1.3 药品与试剂

吡非尼酮胶囊(国药准字H20133376,批号20210414)购自北京康蒂尼药业股份有限公司;D-无水葡萄糖(质量分数≥98%,批号B21882)购自上海源叶生物科技有限公司;肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒(批号2111M33)、白细胞介素-6interleukin-6IL-6ELISA试剂盒(批号2111M25)购自江苏菲亚生物科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseGAPDH)抗体(批号B1501)、TNF-α抗体(批号B7201)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycinmTOR)抗体(批号N1301)、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(批号B0201)均购自美国Immunoway公司;缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)抗体(批号GR3368586-5)购自英国Abcam公司;血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factorVEGF)抗体(批号No.43866)购自美国GeneTex公司。

1.4 仪器

MF-RO-10型实验动物饮用水处理器(杭州永洁达净化科技有限公司);X-RAD225型生物辐照仪(美国Precision X-ray公司);Inlivew-3000B型动物PET/SPECT/CT(北京永新医疗设备有限公司);WPB PLT-UNR-RT-2型动物肺功能仪(德国EMKA公司);SpectraMax i3x型多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司);UV-power型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司);SCIENTZ-48型高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技股份有限公司);WD-9405F型脱色摇床、DYY-60型电泳仪(北京六一生物科技有限公司);SFC-182型生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)。

2 方法

2.1 药物制备

2.1.1 红芪水煎液制备  红芪饮片加入8倍量纯水浸泡6 h后,煎煮1.5 h,滤过,再加入6倍量纯水煎煮1.5 h,合并2次滤液,浓缩得红芪水煎液。

2.1.2 红芪多糖提取纯化  红芪水煎液离心取上清液,进行4次醇沉(分别加入无水乙醇使溶液乙醇体积分数达到70%80%80%90%),每次醇沉后静置24 h,取沉淀加入纯水溶解,离心,取上清液进行下一次醇沉。90%乙醇醇沉后滤过取沉淀,用无水乙醇洗3遍,50 ℃烘干后得红芪粗多糖。将红芪粗多糖用纯水配制为15 mg/mL多糖溶液,加入10%三氯乙酸溶液(多糖溶液与三氯乙酸溶液体积比为41),低温剧烈振荡30 min,离心,取上清液,加入3倍体积95%乙醇溶液醇沉,滤过,干燥后得红芪多糖,1 kg红芪饮片提取纯化得红芪多糖6 g

2.1.3  红芪多糖质量分数测定  以无水葡萄糖为标准品,配制质量浓度分别为0.0240.0350.0470.0590.071 mg/mL的葡萄糖溶液,苯酚硫酸法显色后通过紫外分光光度仪于485 nm处测得吸光度(A)值分别为0.2440.3620.5010.6290.750,以质量浓度为横坐标(X),A值为纵坐标(Y)进行回归分析,得线性回归方程Y10.808 X0.014r0.999 7。精密配制0.042 mg/mL红芪多糖溶液,测得A值为0.364,代入回归方程得所提红芪多糖质量分数为83.27%

2.2 动物分组、模型制备及给药

56只雌性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、红芪水煎液(5 g/kg)组及红芪多糖低、中、高剂量(153060 mg/kg)组和吡非尼酮(200 mg/kg)组,每组8只。所有小鼠ip 3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉,除对照组外,其余各组小鼠均仰卧固定于动物台,充分暴露肺部,进行单次16 Gy全肺X线辐照,未照射部位用铅块屏蔽,照射距离为48 cm,剂量率为2 Gy/min,照射时间8 min;对照组麻醉后佯装辐照。自造模前7 d,各给药组ig相应药物(20 mL/kg),对照组和模型组ig等体积0.9%氯化钠溶液,1/d,连续5周。

2.3 一般状况观察

观察小鼠毛发改变、精神状态、活动度等,每周定时测量并记录小鼠体质量。于造模后28 d取材时测量肺组织质量并计算小鼠肺指数。

肺指数=肺质量/体质量

2.4  肺功能检测

于取材前1 d运用无约束全身体积描记仪对各组小鼠进行清醒状态下肺功能检测。将小鼠放入动物体积描记箱中,待其呼吸状态平稳时记录肺功能指标,包括吸气时间(Ti)、呼气时间(Te)、潮气量(TV)、每分钟通气量(MV)、吸气气流高峰(PIF)、呼气气流高峰(PEF)。

2.5  CT检测

分别于造模1 d前及肺功能检测结束后,对小鼠进行麻醉后CT检测。各组小鼠ip 3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉,以俯卧位放置于小动物PET/CT床位,勾选全肺进行CT扫描。采用NMsoft-AIWS V1.7图像处理软件将扫描结果断层重建后融合显示,选用3D等值线限定CTMin=−1000 HUMax0勾选全肺,软件统计小鼠肺部平均CT值。

2.6  肺组织病理学检测

各组小鼠麻醉后,股动脉取血,脱颈椎处死,取左肺,以10%甲醛溶液固定,经脱水、包埋、切片后,进行苏木素-伊红(HE)染色。采用Szapiel法评价肺泡炎症程度[18]:无肺泡炎症,记0分;轻度肺泡炎,肺泡间隔略微增宽,其间有炎性细胞浸润,病变面积小于全肺20%,记1分;中度肺泡炎,病变面积占全肺20%50%,记2分;重度肺泡炎,病变面积占全肺50%以上,记3分。

2.7  ELISA检测血清中TNF-α和IL-6水平

各组小鼠全血常温静置2 h后,4 ℃、3000 r/min离心15 min,分离血清。按照ELISA试剂盒说明书检测小鼠血清中TNF-α和IL-6水平。

2.8  Western blotting检测肺组织中TNF-α、mTORVEGFHIF-1α蛋白表达

取各组小鼠右肺组织,加入蛋白裂解液,低温匀浆裂解,用高通量组织研磨器(70 Hz)充分研磨肺组织,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,分离上清液。用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度,上清液加入蛋白上样缓冲液,沸水浴10 min,蛋白样品于−20℃保存备用。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转至PVDF膜,用5%脱脂牛奶封闭2 h后,以TBST洗涤3次,分别加入相应抗体,4 ℃孵育过夜;TBST洗涤3次,加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体,室温孵育2 hTBST洗涤后,均匀滴加ECL试剂,暗室曝光,用Image J 1.48V图像处理软件分析条带灰度值。

2.9  统计分析

实验数据均采用SPSS 25.0软件进行统计分析,计量数据中符合正态分布的以表示,多组间比较进行单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐时多重比较采用LSD法检验,方差不齐时采用TamhanesT2法检验。

3 结果

3.1 一般状况观察

3.1.1  小鼠生存状况  如图1所示,对照组小鼠在实验过程中动作敏捷、精神良好、皮毛光泽。其余各组小鼠在辐照后均出现不同程度的动作减缓、精神萎靡。各给药组小鼠在辐照后7 d左右动作、精神状况逐渐恢复,模型组及吡非尼酮组小鼠恢复较慢。小鼠在辐照后21 d左右出现辐照部位毛发脱落。

3.1.2  小鼠体质量变化 如图2所示,辐照后,除对照组小鼠体质量平缓上升外,其余各组小鼠体质量均在7 d内呈下降趋势,7 d后小鼠体质量开始逐渐恢复并上升。其中,模型组及吡非尼酮组上升最慢,红芪多糖高剂量组上升最快。721 d,与对照组比较,模型组小鼠体质量显著降低(P0.01)。14 d时,与模型组比较,红芪多糖中、高剂量组小鼠体质量显著增加(P0.050.01)。21 d时,除吡非尼酮组外,其余各给药组小鼠体质量均高于模型组(P0.01)。

3.2 肺组织病理学观察

如图3所示,对照组小鼠肺组织无明显病理学改变,结构清晰,轮廓完整。模型组小鼠肺组织破坏严重,可见支气管上皮细胞坏死脱落,肺泡间隔明显增宽,肺间质有大量炎性细胞浸润,血管肌层增厚,周围水肿。与模型组比较,各给药组均能在一定程度减轻小鼠肺组织炎症反应,其中红芪多糖中、高剂量组及吡非尼酮组效果较为明显。

如表1所示,与对照组比较,模型组小鼠肺指数和肺泡炎评分显著升高(P0.01);与模型组比较,红芪多糖低、中、高剂量组及吡非尼酮组小鼠肺指数显著降低(P0.01),吡非尼酮组和红芪多糖中、高剂量组小鼠肺泡炎评分显著降低(P0.050.01)。

3.3 小鼠肺功能检测

于辐照后27 d对小鼠进行清醒状态下肺功能检测,如表2所示,与对照组比较,模型组小鼠TiTE显著升高(P0.01),PIFPEFTVMV显著降低(P0.01)。与模型组比较,红芪多糖低、中、高剂量组及吡非尼酮组小鼠TiTE均显著降低(P0.050.01),MV显著升高(P0.01);红芪多糖中、高剂量组及吡非尼酮组TVPEF显著升高(P0.050.01)。

3.4 小鼠肺组织CT值变化

如表2所示,辐照前各组之间小鼠肺部CT值无明显差异。辐照后27 d,与对照组比较,模型组小鼠肺部CT值升高(P0.01);与模型组比较,红芪多糖高剂量组及吡非尼酮组小鼠肺部CT值显著降低(P0.01)。

3.5 血清中TNF-α和IL-6水平

如图4所示,与对照组比较,辐照28 d后模型组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,红芪多糖中、高剂量组及吡非尼酮组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平均显著降低(P0.050.01)。

3.6  肺组织中TNF-α、mTORVEGFHIF-1α蛋白表达

如图5所示,与对照组比较,辐照28 d后模型组小鼠肺组织中TNF-α、mTORVEGFHIF-1α蛋白表达水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,红芪多糖中、高剂量组及吡非尼酮组肺组织中TNF-α、mTORVEGFHIF-1α蛋白表达均水平显著降低(P0.050.01)。

4 讨论

RILI从临床上主要分为炎症期和纤维化期,炎症期常发生于13个月,纤维化期常发生于624个月,而从分子水平观察,RILI则是一个连续进展的过程。肺部辐照产生大量的活性氧和活性氮,氧化损伤DNA、脂质和蛋白质,从而导致肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的损伤或凋亡。随后,许多炎性细胞被募集到损伤部位,并分泌大量细胞因子,进而产生一系列细胞因子级联反应,介导炎症反应及后期的纤维化[19]。由于肺纤维化的不可逆性及难治性,在肺炎时期采取积极的干预措施对防治RILI具有重要意义。

组织病理学、肺功能及CT影像学检测在诊断RILI中发挥重要作用,可有效评价RILI程度及发展阶段[20]。本研究根据文献调研及前期预实验结果综合分析,最终采用单次16 Gy全肺X线辐照建立RILI模型,于辐照后28 d取材。肺组织HE染色结果显示,模型组小鼠肺组织结构破坏严重,炎性细胞浸润明显;肺功能及CT检测结果显示,模型组小鼠肺功能明显受损,肺部CT值显著升高;而给予红芪多糖后可减少小鼠肺组织炎症细胞浸润,改善肺功能各项指标,降低肺部CT值。在肺功能检测结果中,红芪多糖组小鼠PIF虽较模型组有所提高,但差异不具统计学意义,可能是由于小鼠并没有自主用力吸气意识导致结果并不完全准确。RILI前期炎症CT影像学表现在动物模型中并不明显,可表现为均匀的斑片状、小结节状磨玻璃影或实变影等,在后期纤维化时可出现条状、带状纤维条索影等[21]。由于本研究只进行到辐照后28 d,小鼠尚未出现明显的肺纤维化,故通过比较各组间辐照前后CT值来统计分析CT结果。肺部CT值是X线辐照衰减在CT图像上的量化指标,能客观地评价肺组织密度,反映肺组织损伤程度,可应用于辅助诊断RILI[22]。以上结果表明RILI小鼠模型成功建立且红芪多糖对RILI具有一定保护作用。

在肺部辐照早期,TNF-α、IL-6等细胞因子的过度表达对RILI的发生发展起到了重要作用。TNF-α是RILI炎症阶段的启动因子,通过诱导黏附分子的表达,招募炎性细胞到组织损伤部位,启动炎性细胞产生氧化物,从而发挥促炎作用[23]IL-6是下丘脑-垂体-肾上腺轴的内源性调节因子,在炎症过程中的免疫-神经内分泌调节中发挥重要作用[24]。临床研究亦显示,循环IL-6早期变化可作为预测放射性肺炎的指标[25]。因此,检测小鼠血清中TNF-α和IL-6水平可在一定程度反映RILI前期肺炎损伤情况,且在初始阶段对TNF-α和IL-6进行药理调控可能会阻止RILI的进展。本研究发现模型组小鼠辐照后血清中TNF-α及IL-6水平显著升高,而红芪多糖可下调TNF-α及IL-6水平,提示红芪多糖减轻RILI前期炎症损伤可能与抑制TNF-α及IL-6的释放有关。

Fleckenstein[26]研究发现,RILI炎症期、纤维化期与组织缺氧有关。肺部辐照后几周内就会发生血管损伤,如内皮细胞肿胀导致毛细血管狭窄和闭塞、较大血管内纤维蛋白栓的形成及内皮细胞增生等,从而导致组织缺氧[27]。而在缺氧条件下,HIF-1α激活VEGF过表达,从而促进血管内皮细胞增殖,诱导血管生成,增加血管通透性,导致肺高渗性水肿和毛细血管内皮细胞损伤,引起肺部炎症[28-29]mTORHIF-1α的上游基因,mTOR激活可以使HIF-1α入核,进而调控下游的VEGF表达,加重炎症损伤[30]。本研究结果显示,辐照后小鼠肺组织mTOR蛋白表达显著增加,并伴随着HIF-1α、VEGFTNF-α上调;而红芪多糖可以降低小鼠肺组织中mTORHIF-1α、VEGFTNF-α蛋白表达,表明红芪多糖改善RILI的作用可能与抑制mTOR/HIF-1α/ VEGF信号通路有关。

综上所述,红芪多糖有明显改善RILI炎症的作用,其机制可能与下调mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路从而抑制TNF-α和IL-6等炎症因子的释放有关。吡非尼酮改善RILI前期炎症的总体效果优于红芪多糖,但从体质量变化趋势分析,吡非尼酮组小鼠辐照后体质量下降明显且恢复较慢,考虑为吡非尼酮诱发小鼠出现胃肠道反应甚至肝损伤所致。而红芪多糖中、高剂量组对前期肺炎也有较好的治疗作用,且辐照后体质量均快速回升,并未出现不良反应。由此可以考虑为红芪多糖的毒副作用低于吡非尼酮,需要进一步深入研究。本研究只进行到辐照后28 d,病理上处于放射性肺炎阶段,关于红芪多糖对RILI后期肺纤维化阶段的作用效果及机制有待后续探索研究。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献(略)

 源:王  强,王  艺,张  莉,尚  芸,李亮亮,杜籼芹,李  爽,蔺兴遥.基于mTOR/HIF-1α/VEGF通路研究红芪多糖防治放射性肺损伤的作用机制  [J]. 中草药, 2022, 53(21): 6771-6779 .

转自:“如沐风科研”微信公众号

如有侵权,请联系本站删除!


  • 万维QQ投稿交流群    招募志愿者

    版权所有 Copyright@2009-2015豫ICP证合字09037080号

     纯自助论文投稿平台    E-mail:eshukan@163.com