深圳大学刘宇辰团队开发新的技术增强蛋白质的翻译

新的长链非编码RNA ( long noncoding RNAs，lncRNAs )参与了包括mRNA翻译在内的各种生物学过程，但作为生物技术或治疗工具的使用仍处于起步阶段。一个重要的问题是，lncRNA功能元件是否可以通过整合靶向RNA的CRISPR工具来靶向翻译感兴趣的mRNA。

2023年1月30日，深圳大学刘宇辰团队在Nucleic Acids Research 上在线发表题为“Enhancement of protein translation by CRISPR/dCasRx coupled with SINEB2 repeat of noncoding RNAs”的研究论文，该研究开发了一种CRISPR / dCasRx - SINEB2技术，将具有催化活性的非活性Type VI-D Cas13酶( CasRx )的sgRNA与促进靶mRNA翻译的uchl1 lncRNA的整合SINEB2结构域偶联。

dCas Rx- SINEB2是目前唯一的CRISPR相关的翻译控制基因表达的技术，在可比条件下的效果与传统的RNAe工具相当甚至更好。此外，通过dCasRx - SINEB2靶向编码抗肿瘤蛋白(包括PTEN和P53 )转录本的mRNA翻译，可以在体外和体内阻止人类癌细胞的增殖和迁移。总之，该研究提供了一种创新的蛋白质增强方法，或将在生物制药生产和癌症研究中得到广泛应用。

在哺乳动物中，转录产生多种转录本，包括重复序列如SINEs (短的穿插核元素)、长链非编码RNA ( long noncoding RNAs，lncRNAs )和蛋白质编码的信使RNA ( mRNAs )。虽然非编码RNA转录本在细胞中广泛分布，但对其生物学意义知之甚少。目前在转录水平上已经鉴定出少数基因表达调控因子。研究发现，长链非编码RNA ( long noncoding RNAs，lncRNAs )功能家族具有重叠的反义模式，能够靶向mRNAs的5′末端，从而增强所连接蛋白质的翻译。泛素羧基末端水解酶L1 ( AS Uchl1或Uchl1os)的反义基因是第一个激活Uchl1翻译的lncRNA。它的活性基于两个结构域的结合：一个能够增强mRNA翻译的反向SINEB2重复序列(效应域, ED)和一个为目标正义转录本提供特异性(结合域, BD)的重叠反义区域。这一发现增加了我们对非编码RNA如何调控基因表达的理解。

计算研究发现，小鼠基因组中含有超过10000个具有SINEB2序列的lncRNA，因此可以生成这样的反义lncRNA来提高某种mRNA的翻译能力。独特的反义uchl1 lncRNA具有一个倒置的SINEB2基序和5′配对序列，在翻译起始密码子AUG周围，正义mRNA序列与72个核苷酸( nt )配对区域( -42 ~ + 32)完全互补。此外，SINEB2基序通过增强核糖体募集来提高翻译，而不提高mRNA水平。由于目前激活mRNA翻译的技术较少，对于翻译增强至关重要的反向SINEB2基序有可能被用来创建新的激活翻译的工具。然而，反义RNA直接结合靶mRNA的能力可能较弱，因此需要构建文库来鉴定那些具有最佳匹配特性的反义RNA。

CRISPR/dCasRx-SINEB2发展示意图（图源自Nucleic Acids Research ）

控制基因组DNA最适用的技术之一是CRISPR - Cas9系统，该系统不仅可以编辑基因序列，还可以同时激活或抑制内源基因的转录。除调控DNA外，CRISPR技术还可用于调控RNA。CRISPR相关核酸酶Cas13技术的进步使得精确编辑mRNA和检测生物过程中的RNA变化成为可能。Cas13酶结合并切割与其向导RNA互补的单链RNA分子。Cas13家族蛋白包括Cas13a ( 1250 aa )、Cas13b ( 1150 aa )、Cas13c ( 1120 aa )和Cas13d ( 930 aa )，已被报道具有相当的RNA敲低和最小的脱靶效应。

Cas13家族中最小的已知酶RfxCas13d ( CasRx )表现出最好的靶向敲低性能。以往将无催化活性的Cas Rx ( dCas Rx )连接到m6A写入子或擦除子的策略可以操纵相关Cas13引导RNA靶向的特定m6A位点。然而，基于CRISPR - dCasRx的装置仍然不能调控mRNA的翻译。尽管基于CRISPR的转录因子可以直接控制基因转录，但许多基因的mRNA和蛋白表达水平并不总是之与成比例。

为了解决上述问题，本研究设计开发了一种基于CRISPR - dCasRx的靶向特定mRNA蛋白翻译的方法。将无催化活性的Cas13Rx - sgRNA与SINEB2元件连接，产生人工合成的RNA复合物，用于哺乳动物蛋白编码基因的翻译刺激。CRISPR - dCasRx - SINEB2有效地操纵了内转录本中的蛋白质激活，在癌症和健康的哺乳动物细胞中仅产生了细微的脱靶变化。

基于dCas Rx的翻译调控因子的小尺寸使得dCas Rx和crRNA - SINEB2结构都可以包装成一个单一的腺相关病毒( all-in-one AAV )载体来处理其他策略难以转染的细胞。此外，为了提高CRISPR - dCasRx - SINEB2在不同情况下的效率，扩大其适用范围，研究人员将将CRISPR - d CasRx - SINEB2系统用于抗癌基因靶点，有效抑制了细胞迁移和增殖，表明该设计工具具有生物技术潜力。总之，该研究为体内基因特异性mRNA翻译增强提供了有力的工具，并为分子治疗提供了一类新的基于RNA的药物。此外，这是目前所知的第一个基于CRISPR启动基因翻译的技术。

参考信息：

https://doi.org/10.1093/nar/gkad010

转自：“iNature”微信公众号

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