导读
雷公藤多苷片（TWP）是一种中药制剂，具有多种药理特性，包括抗炎、免疫调节和抗增殖活性。然而，TWP的生殖毒性极大地限制了其临床应用，TWP诱导生殖毒性的机制尚未被研究者们所完全了解。本研究旨在探讨TWP诱导雄性大鼠睾丸损伤的机制。我们首次通过代谢组学和转录组学的结合研究了TWP诱导大鼠睾丸损伤的机制。同时我们还进行组织病理学分析、免疫印迹分析（Western blot）和实时聚合酶链反应定量分析（RT qPCR）以证实TWP对大鼠睾丸的损伤作用和机制。组织病理学分析显示，TWP具有显著的睾丸损伤，这严重降低了睾丸的管状直径和上皮高度。此外，TWP导致ZO-1、CLDN11、PLZF和OCT4的蛋白水平显著下调，表明血-睾丸屏障功能和精子发生受损。与正常大鼠组相比，TWP处理大鼠的睾丸中出现差异表达基因（DEGs），包括4952个上调和2626个下调。此外，我们从睾丸样本中鉴定出77种变化的代谢物。通过对DEG和差异代谢产物的综合分析，我们发现谷胱甘肽代谢和铁死亡在睾丸损伤中起着重要作用。并且，铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11和NRF2的水平显著下调，4-HNE（脂质过氧化和氧化应激的主要产物）的蛋白水平上调。铁死亡相关基因的变化表明TWP可能促进大鼠睾丸铁死亡。这些结果表明，铁死亡与TWP引起的睾丸损伤有关，这可能为减轻TWP导致的睾丸损伤提供了一种新的策略。
亮点：
1. TWP致雄性大鼠睾丸损伤呈剂量依赖性和时间依赖性；
2. 转录组学和代谢组学的结合揭示了TWP诱导睾丸损伤的机制；
3. TWP诱导的睾丸损伤涉及谷胱甘肽代谢障碍和铁死亡。
论文ID
原名：Integration of metabolomics and transcriptomics to reveal ferroptosis is involved in Tripterygium wilfordii polyglycoside tablet-induced testicular injury
译名：代谢组学和转录组学整合分析揭示铁死亡参与雷公藤多苷片诱导的睾丸损伤
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2022.12
通讯作者：金晶
通讯作者单位：中山大学药学院
【期刊简介】
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实验结果
1. TWP致睾丸损伤
雷公藤多苷片的液相色谱质谱（LC-MS）总离子色谱图如图S1所示。先前的研究表明，36 mg/kg TWP处理类风湿性关节炎（RA）大鼠6周可能会导致睾丸损伤。为了深入阐明TWP诱导的睾丸损伤的特征，我们用TWP（60、120 mg/kg）处理大鼠3或6周。我们根据先前的研究和临床剂量选择大鼠体内的TWP剂量。结果表明，TWP处理显著降低了睾丸/体重比（图1 A–B）。与对照组相比，给予大鼠60和120 mg/kg TWP处理6周后，睾丸/体重比分别显著降低约30%和60%。同样，苏木精和伊红（H&E）染色分析结果显示TWP引起睾丸损伤，特别是睾丸小管直径和上皮高度的降低（图1C）。
图1 TWP导致睾丸损伤
（A）睾丸组织指数（组织重量/体重× 100%，n = 5）。（B）睾丸体积大小（n = 3）。（C）H&E染色睾丸切片的显微照片（n = 3）。（D）TWP处理6周后大鼠睾丸中ZO-1、PLZF、OCT4和CLDN11表达的免疫印迹分析；GAPDH用作内参对照（n = 3）。数据以平均值±标准差。*表示，p < 0.05，**表示，p < 0.005。
图S1 雷公藤多苷片的LC-MS总离子色谱图
为了进一步探讨TWP对睾丸功能的影响，我们使用免疫印迹分析（Western blot）检测了血-睾丸屏障和精子发生相关蛋白的水平（图1D）。结果表明，TWP（120 mg/kg）处理6周后，血睾丸屏障相关蛋白ZO-1和CLDN11的水平分别下调64%和72%。此外，生殖发育相关蛋白PLZF和OCT4的水平显著下调62%和75%。总之，这些结果表明，TWP可诱导睾丸损伤，并且TWP可破坏血-睾丸屏障并损害生殖发育。
表1 引物序列
（Gpx4，谷胱甘肽过氧化物酶4；Hox1，血红素加氧酶1；Acsl4：酰基辅酶A合成酶长链家族成员4；Ggt6，γ-谷氨酰转移酶6同系物；Ggt7，γ-谷氨酰转移酶7）
图S2 睾丸差异表达基因热图（n= 3）
2. 睾丸的转录组改变
为了阐明TWP诱导的睾丸损伤的发病机制，我们使用转录组测序（RNA-seq）分析来建立对照组和TWP（120mg/kg，持续6周）组之间的基因表达谱。满足Q值≤ 0.05和|倍数变化| > 1的基因被选为差异表达基因（DEGs）。火山图捕捉了基因的变化（图2B）。结果表明，与对照组相比，TWP组有7578个基因显著表达，其中4952个基因上调，2626个基因下调。热图显示了Q值最低的前100个DEGs（图2A，图S2）。《京都基因和基因组百科全书》（KEGG）分析表明，谷胱甘肽代谢、维生素B6、脂肪酸代谢和铁死亡与TWP引起的睾丸损伤有关（图2C）。此外，基因本体（GO）表明，生殖过程在生物过程中显著丰富（图2D），这表明TWP改变了生殖过程。
图2 对照组和TWP处理组大鼠睾丸组织的转录组学分析
（A）DEGs的热图（n = 3）。（B）DEGs火山图。Q值≤ 0.05被标记为显著的基因。（C）DEGs的KEGG分析。（D）生物过程中DEGs的基因本体分析。（E）差异性铁死亡基因的蛋白-蛋白相互作用网络分析。（F）铁死亡相关基因的热图（n = 3）。（G）铁死亡相关基因的表达水平（n = 3）。数据以平均值±标准差表示。*，p < 0.05，***，p < 0.001，***，p < 0.0001。
谷胱甘肽是一种抗氧化剂，对保护生殖系统很重要。谷胱甘肽信号通路的紊乱会影响睾丸的抗氧化应激功能，进而对血-睾丸屏障和睾丸功能产生不利影响。铁死亡是各种疾病过程中细胞程序性死亡的一种形式，以铁超载和脂质过氧化为主要特征存在。我们通过string数据库对差异性铁死亡基因进行了蛋白-蛋白相互作用分析（图2E），该数据库提供了TWP引起的睾丸损伤中转录水平变化的信息。为了探索铁死亡相关基因的表达，我们对转录组数据进行了进一步分析。为了更好地捕捉铁死亡相关基因的变化，我们构建了热图以提供图像视图（图2F）。与对照组相比，TWP使铁死亡相关基因Gpx4、Ggt6和Ggt7的水平分别降低了约44%、91%和81%。睾丸铁死亡相关基因检测的方案如表2所示。与对照组相比，TWP处理使Hox1和Acsl4的表达上调了57%和87%（图2G）。RNA-seq分析结果表明，铁死亡与TWP引起的睾丸损伤有关。
表2 铁死亡相关DEGs的信息
图S3 不同组的主成分分析（PCA）模型
（A）TWP处理3周的PCA模型（n = 5）。（B）TWP处理6周的PCA模型（n = 5）；（C）TWP（60mg/kg）处理的PCA模型（n = 5）；（D）TWP（120 mg/kg）处理的PCA模型（n = 5）。
3. TWP处理睾丸的非靶向代谢组学分析
为了进一步探讨TWP诱导睾丸损伤的机制，我们进行了非靶向代谢组学研究，以揭示TWP处理后睾丸的代谢特征。PCA模型用于获得数据的概览，检测异常值，并评估代谢组学差异（图S3）。PCA评分图显示，TWP处理6周后的代谢状态与对照组明显不同，表明TWP改变了睾丸的代谢状态（图3A）。为了研究TWP诱导睾丸损伤的机制，我们构建了正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）模型，以发现不同的代谢产物（图3B）。200次置换试验得出的负离子模式下截距值为R2 = 0.569，Q2 = − 0.634，正离子模式下截距值为R2 = 0.946和Q2 = 0.909（图3C），显示出良好的适应度和预测能力。睾丸代谢组学分析如图3D所示。
图3 对照组和TWP处理组大鼠睾丸组织的代谢组学分析
（A）TWP治疗6周的PCA评分图（n = 5）。（B）TWP（120 mg/kg）处理6周（n = 5）的OPLS-DA评分图。（C）进行了200次迭代的置换检验，然后该OPLS-DA模型在没有过度拟合的情况下是有效的（n = 5）。（D）TWP（120 mg/kg）处理6周（n = 5）的S图。
4. 代谢产物的特征和途径富集
我们从睾丸样品中鉴定出77种不同的代谢物（图S4）。为了更好地捕捉代谢变化，我们构建了热图，以使用所有组提供图像视图。代谢产物变化与组织学分析一致（图4 A–D）。所有改变的代谢产物都被导入MetaboAnalyst 5.0进行通路分析，以进一步描述潜在机制。TWP和对照组在代谢组学水平上确定的主要代谢途径包括谷胱甘肽代谢、核黄素代谢、精氨酸、牛磺酸代谢和其他途径（图4E）。先前的研究报道精氨酸、脯氨酸代谢和谷胱甘肽代谢对睾丸功能有重要影响。
在谷胱甘肽代谢相关代谢产物中，120 mg/kg TWP处理6周显著降低了谷胱甘肽（p < 0.001）、γ -谷氨酰半胱氨酸（p < 0.001）和L-谷氨酸（p < 0.001）的水平，分别约为50%、50%和33%，表明TWP阻断谷胱甘肽代谢（图4F）。此外，据报道，谷胱甘肽途径的代谢紊乱可能导致焦谷氨酸增加，我们发现TWP组焦谷氨酸显著增加了> 20倍（p < 0.0001）（图4F）。
图4 代谢产物的特征和通路富集
（A–D）TWP处理对睾丸代谢产物影响的热图（n = 5）。（E）不同代谢产物的通路分析。（F）TWP处理（120 mg/kg）6周后睾丸谷胱甘肽代谢相关代谢产物分析（n = 5）。数据以平均值±标准差表示。*，p < 0.05，**，p < 0.005，***，p < 0.001，***，p < 0.0001。
5. TWP致大鼠睾丸损伤与铁死亡有关
为了进一步证实上述发现，我们通过Western blot和RT-qPCR进一步分析了铁死亡相关基因。谷胱甘肽是GPX4的辅因子，谷胱甘肽的缺乏导致GPX4失活，进而导致铁死亡。TWP（120 mg/kg）处理6周后，GPX4、SLC7A11（为谷胱甘肽生物合成和抗氧化防御输入胱氨酸）和NRF2的蛋白水平分别下调86%、63%和86%（图5A）。4-HNE是脂质过氧化和氧化应激的主要产物之一，在铁死亡的发生和发展中起着重要作用。如图5A所示，在TWP处理后，4-HNE的蛋白质水平上调了34%。此外，我们通过RT-qPCR检测铁死亡相关基因的mRNA水平。如图5B所示，ROS响应基因Hox1、Acsl4的mRNA水平上调175%和194%，谷胱甘肽代谢相关基因Ggt6和Ggt7的mRNA水平显著下调64%和58%。此外，Gpx4的mRNA水平显著下调84%。总之，这些证据表明TWP引起的睾丸损伤与铁死亡密切相关。
图5 TWP（120 mg/kg）处理6周对睾丸中铁死亡相关基因的影响
（A）用免疫印迹分析NRF2、SLC7A11、GPX4、4-HNE在睾丸中的蛋白表达，GAPDH作为对照（n = 4）。（B）通过RT-qPCR测定铁蛋白脱蛋白相关基因的mRNA水平（n = 4）。数据以平均值±标准差表示。*，p < 0.05，**，p < 0.005，***，p < 0.001，***，p < 0.0001。
讨论
雷公藤多苷片（TWP）具有显著的抗炎和免疫抑制作用，广泛用于RA的治疗。然而，TWP引起的严重生殖损伤往往限制了其临床应用。在本研究中，我们研究了TWP诱导的睾丸损伤的特征，并通过转录组学和代谢组学的结合进一步探讨了其毒性机制。我们首次发现铁死亡与TWP引起的睾丸损伤有关，这可能为治疗生殖损伤提供了一种新的策略。
先前的报告显示，TWP可导致RA大鼠睾丸损伤。为了描述TWP诱导的睾丸损伤的特征，我们用TWP（60 mg/kg，120 mg/kg）处理大鼠3周或6周，同时根据先前的研究和临床剂量选择大鼠体内TWP的剂量。我们发现TWP可以减少睾丸重量和体积，病理切片结果表明TWP导致曲细精小管空泡化和生殖细胞减少。血-睾丸屏障（BTB）可以阻止异种物质进入生精上皮，并为生精细胞提供免疫优先环境，这对维持男性生育能力至关重要。紧密连接蛋白，如ZO-1和CLDN11，是BTB的重要组成部分。一份研究报告证实，CLDN11缺乏可能导致小鼠不育。PLZF是睾丸生殖细胞基因的标志物。在本研究中，ZO-1、CLDN11和PLZF的蛋白表达显著降低，这表明TWP可以破坏BTB并抑制男性生育能力。
代谢组学和转录组学一致显示TWP引起的睾丸损伤与谷胱甘肽代谢相关。谷胱甘肽在解毒氧自由基和自由基、储存和转移半胱氨酸和thioldisulfide等方面具有重要功能。因此，我们有必要保持细胞和组织中的氧化还原平衡。许多研究表明，TWP可能导致氧化应激和氧化还原稳态失衡。我们观察到睾丸中的谷胱甘肽、γ-谷氨酰半胱氨酸L-谷氨酸显著降低，这表明睾丸的抗氧化能力降低。此外，谷胱甘肽代谢相关基因Ggt6和Ggt7显著降低。已知谷胱甘肽是GPX4催化过程中的一个关键辅因子，谷胱甘肽缺乏会导致GPX4失活，进而导致铁死亡。
本研究中的新发现是，铁死亡与TWP引起的睾丸损伤有关。铁死亡是一种由铁依赖性磷脂过氧化驱动的细胞死亡模式。它可以通过多种细胞代谢途径，如氧化还原、线粒体活性等，被调节。因此，铁死亡在许多疾病和外来生物引起的器官损害的发生和发展中起着重要作用。最近的研究表明，铁死亡与生殖系统密切相关。例如，抑制铁死亡可以缓解白消安引起的小鼠精子减少。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯暴露通过HIF-1α/HO-1信号和基因诱导的小鼠睾丸损伤导致铁死亡。更重要的是，临床结果还表明，铁死亡与生殖障碍密切相关。一项研究发现，重型β-地中海贫血（β -TM）患者患有性腺功能减退和精子生成缺陷，这是由于垂体和睾丸中的铁积累导致的。因此，对铁死亡及其调节机制的研究将为治疗各种男性生殖疾病提供一个创新的思路。
脂质过氧化是铁死亡的一个重要特征。4-HNE是脂质过氧化和氧化应激的主要产物之一，在铁死亡的发生和发展中起着重要作用。我们的结果表明，TWP处理显著增加了4 -HNE含量。研究人员还发现，弱精子症患者中GPX4和SLC7A11的表达水平与铁死亡增加和精子功能受损有关，揭示了男性不育复杂系统的新分子见解。GPX4的失活通过脂质过氧化产生的ROS的积累导致铁死亡。SLC7A11是谷胱甘肽生物合成和抗氧化防御所必需的半胱氨酸，也是铁死亡的抑制剂。我们发现，TWP暴露不仅显著降低了Gpx4的mRNA水平，而且显著降低了Gpx4蛋白水平。此外，TWP还显著降低了SLC7A11在睾丸中的表达。这些结果表明，铁死亡可能在TWP诱导的睾丸损伤中起重要作用，可能是由于谷胱甘肽水平降低。然而，本研究存在一些局限性。TWP如何促进睾丸的脱铁，以及抑制铁死亡是否能减轻TWP引起的睾丸损伤，目前尚未得到充分的研究。因此，我们需要进一步研究铁死亡在TWP引起的睾丸损伤中作用的潜在机制。
结论
在这项研究中，我们发现TWP可以导致睾丸损伤。转录组学和代谢组学的整合表明，铁死亡与TWP诱导的睾丸损伤有关。这项研究揭示了TWP引起睾丸损伤的新机制，并可能为减轻TWP引起的生殖毒性提供新的策略。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36539070/
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