以下文章来源于iProteome ，作者刘慧
本期iproteome给大家带来日本国家癌症中心研究所Hiroyuki Mano研究团队于2021年8月发表在Nature Cancer上的“Multi-omic profiling of peritoneal metastases in gastric cancer identifies molecular subtypes and therapeutic vulnerabilities”，该研究对晚期胃癌患者进行了全面的基因组研究，揭示胃癌的多个腹膜转移的潜在分子靶点，探索了靶向TEAD家族蛋白对克服靶向药物耐药的潜力。
撰文|刘慧
研究背景
胃癌是全球癌症死亡的第三大原因，其中腹膜转移和恶性腹水是晚期胃癌患者最常见的死亡原因，尤其是难治的弥漫型胃癌（DGC）。本研究利用测序技术揭示了胃癌基因组中的基因改变为抗受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2（ERBB2）治疗或免疫检查点治疗提供了潜在的治疗途径。在临床应用上，分子靶向治疗仅限于小部分胃癌患者受益，目前尚无DGC特效疗法。一方面是因为这类肿瘤中富含基质，难以精确分析癌细胞的转录组学、表观遗传学和基因组改变，因此无法确定分子亚型和治疗靶点；另一方面是目前只有极少数DGC细胞系可用，无法广泛开展DGC细胞系的药物试验。
本研究对来自98名患者的恶性腹水样本及相应的肿瘤细胞系进行了全基因组测序（WGS）、RNA测序（RNA-seq）、DNA甲基化和增强子图谱分析。结果发现，DGC可分为两种不同的分子亚型。其中一种亚型中，TEAD通路的抑制可克服治疗耐药，有望开发针对该亚型难治性胃癌的潜在分子靶向策略。
研究结果
1.恶性腹水胃癌的基因组学图谱
本研究从76例DGC患者的腹水样本中纯化了肿瘤细胞，此外，作者还基于59例恶性腹水样本建立了胃癌细胞系（图1a）。通过三种互补的驱动基因检测算法（MutSigCV2，dNdScv和MutPanning），对来自98例患者的233个样本（76个纯化的肿瘤细胞样本、98名匹配的PBMC样本和59个细胞系）鉴定了正选择的单核苷酸变体（SNV）。突变结果显示，CDH1、TP53、ARID1A、RHOA、KRAS和PIGR被确定为三种算法支持的重要驱动基因。此外，该数据集揭示了六个独特的单碱基替换（SBS）特征（图1b）。
图1 恶性腹水胃癌的分子改变图谱
2.恶性腹水胃癌的单核苷酸变异(SNVs)和体细胞拷贝数改变(CNAs)
PIGR编码多聚免疫球蛋白受体，已被证明是胃癌的驱动因子，在IgA穿过胃肠道粘膜上皮的胞吞过程中起着关键作用。PIGR的表达受IL-17、TLR和NF-κB途径的调节（图2a）。图2b显示98个样本中PIGR突变的分布情况；在这些样本中共检测到三种体细胞突变形式：5个移码突变，3个无义突变，1个剪接位点突变（图2b）。此外，PIGR突变也在其它数据库（TCGA和香港队列）中也得到了验证；结果显示PIGR突变多数是截断突变。在TCGA 和香港GC队列中，PIGR和其他驱动基因存在共突变（图2c），且与CDH1或RHOA呈现显著共突变效应。PIGR作为肿瘤抑制基因（截断突变），其表达常与免疫微环境或上皮间质转化(EMT)功能相关，但PIGR缺失的致癌作用尚未被揭示。
随后，作者分析了28,376个潜在的功能性非编码SNV，结果发现了在腹水癌细胞中，HNF4结合基序的扩增和CTCF和RAD21结合基序的缺失（图2d）。此外，还发现了常见的癌症驱动基因，如KRAS、FGFR2、MET、ERBB2、EGFR, MYC, CD44, CCND1，GATA6的扩增，和CDKN2A/B, TP53, PTEN, SMAD4的缺失（图2e）。一般情况，对基因座的系统检测经常受到结构变异(SVs)的影响，因此对基因组的结构变异进行检测，发现了位于FHIT、WWOX、MACROD2和IMMP2L等已知位点出现了结构变异断点。其中，ARID1A、CDKN2A、CDH1、SMAD4等抑癌基因或KRAS、CD44、GATA6等发生扩增的基因，检测到较少的结构变异断点（图2f）。
通过比较转移性胃癌队列HMF(n= 29)和本文队列(n= 98)的驱动基因的扩增频率。发现本文队列中独特的遗传改变模式，表现为KRAS和FGFR2扩增频率增加，ERBB2扩增频率减少（图2g）。进一步研究这些CNAs是否已经存在于原发肿瘤细胞中，随后引起腹膜转移，或是否与转移直接相关的继发性事件。在本文队列中，作者比较了原发肿瘤和转移性癌细胞的基因扩增状态。在原发GC组织中发现FGFR2(红色)和MET(右图红色)的扩增，着丝粒(绿色)。提示这些CNAs已经存在于原发肿瘤细胞中，随后引起腹膜转移，是与转移直接相关的继发性事件（图2h）。
图2 从腹水和患者来源细胞系纯化的肿瘤细胞中的驱动基因改变
3.转录组分析揭示EMT表型
基于RNA-seq数据集，本研究利用层次聚类将59个胃癌细胞系分成两个不同的簇（图3a）。两组间表达差异最大的基因与上皮细胞-间充质转化（EMT）有关，因此将两组分别命名为EMT组和非EMT组（图3b）。由于TGF-β信号在EMT中的关键作用，本研究检测了参与TGF-β通路的相关基因的表达（图3c）。比较患者来源细胞系，和从腹水中纯化的原发肿瘤细胞中TGF-β通路相关基因在EMT组与非EMT组的表达水平，结果显示在EMT组中SMAD3/7和TGF-β受体配体的表达显著升高。
随后，本研究分析了TGF-β1/2蛋白是否直接从胃癌细胞中产生，发现TGF-β1在胃癌细胞培养物的上清液中含量丰富（图3d，左）。由于TGF-β通路可能对肿瘤的发生和发展起着促进或抑制的影响，随后本研究评估了TGF-β配体表达是否发挥促癌作用或抑癌作用。结果显示，TGF-β1仅在非EMT组中抑制细胞系增殖，但不影响EMT组中细胞系增殖（图3d，中，右）。LINC00842 (ELIT-1)是一种长链非编码RNA，已知与SMAD3相互作用，导致EMT的发生（图3e）。此外，研究发现在EMT和非EMT两组中都存在丰富的基因突变。EMT组中富集MET扩增(P = 0.013)和CDKN2A/B纯合缺失(P = 0.0069)，而非EMT组富集FGFR2扩增(P = 0.007)（图3f）。总体而言，EMT组的体细胞突变数量显著低于非EMT组。
图3 胃癌中EMT组伴腹膜转移
4.EMT组中Hippo通路激活
EMT和非EMT组之间的基因集富集分析（GSEA）显示，上皮基质转化，YAP信号，HIPPO信号在EMT组中富集（图4a，b）。由于Hippo通过下游YAP调控细胞增殖和器官大小，TAZ和TEAD1/2/3/4转录效应子在功能上相互作用。TEAD1、TEAD2、TEAD4和WWTR1在EMT细胞株中显著过表达，提示EMT簇中YAP–TAZ–TEAD通路的激活（图4c）。随后，对来自EMT组的原发GC样本进行免疫组化验证，结果显示在EMT组中，TEAD1、SMAD3和 pSMAD3的蛋白质水平在两种细胞系中均增加（图4d）。此外，在EMT组的原代组织中也观察到SMAD3和TEAD1蛋白的上调（图4e）。通过比较癌细胞系百科全书细胞系(CCLE)中SMAD3与YAP1、WWTR1、TEAD1表达水平的关系。结果显示SMAD3的表达水平与参与YAP-TEAD途径的基因在GC细胞系/所有癌细胞系中均呈现明显正相关性（图4f）。
图4 EMT组中YAP–TAZ–TEAD通路的激活
5.EMT组和非EMT组超级增强子(SE)与甲基化组分析
由于癌细胞经常依赖超级增强子（SE）构成的转录回路，本研究对超级增强子SE分析，确定了EMT/非EMT组特定的SE（图5a、b）。有趣的是，EMT组和非EMT组中的关键转录因子不同。SMAD3是EMT组核心调控回路中主要转录因子，其次是RUNX1、BHLHE40和TEAD1转录因子（图5c）。在44个胃癌细胞系的全基因组甲基化分析中，EMT组有216个甲基化位点，非EMT组有359个甲基化位点（图5d）。上述鉴定到的转录因子，主要参与EMT过程或Hippo途径，并且在EMT组中高表达，其甲基化和基因表达水平呈现负相关（图5e）。
图5 胃癌伴腹膜转移的表观遗传控制
6.超级增强子(SE)与基因组结构变异(SV)的相关性分析
鉴于许多异常超级增强子(SE)是由癌症中的结构变体(SV)等遗传改变产生的，本研究分析了基因组结构异常与上述超级增强子SE的相关性。在KLF5、ELF3 基因座处发现了高频的结构变异SV（图6a，b）。EHF增强子主要受拷贝数增加的影响（图6c）。
图6 通过基因改变增强编码核心调控转录因子的基因
7.腹膜转移胃癌的分子靶点研究
为了探究RTK通路中基因突变是否存在腹膜转移胃癌的潜在治疗机会。本研究使用了六种分子抑制剂，即FGFR、MET、ALK、EGFR、ERBB2和MEK1/2抑制剂，靶向相应细胞系。其中，ALK抑制对EML4-ALK融合扩增的患者有效（图7a）。在大多数细胞系中，基因扩增之后其表达升高，使用抑制剂效果显著。FGFR2和MET抑制的效果几乎与每个基因的表达水平成正比，只有少数例外。只有在EGFR扩增的细胞系中，抑制EGFR才有效（图7b）。这些研究表明RTK通路基因的高水平扩增和融合可能是胃癌中可靠的生物标志物。随后，作者比较了发生基因扩增/融合与野生型患者来源细胞系的生存能力，结果显示细胞系的基因扩增之后其基因高表达，使用抑制剂效果显著（细胞生存降低）（图7c）。将胃癌细胞系经腹膜内注射到CB-17 SCID小鼠中来构建体内腹膜转移小鼠模型，随后使用靶向药物口服给药小鼠，结果发现给药后可迅速消除小鼠的癌细胞（图7d）。
图7 胃癌腹膜转移的分子靶点
8.EMT组中的TEAD抑制
使用癌细胞系百科全书(CCLE)数据进项功能缺失筛选的分析，结果显示在GC细胞系/其他癌细胞系依赖于YAP-TEAD通路中的基因，而不是SMAD3，尽管SMAD3和那些基因是的表达水平是成比例的（图8a）。为了探索在EMT组中药物抑制TEAD通路治疗胃癌的可能性。K-975作为分子TEAD抑制剂，可阻断YAP-TAZ与TEAD15之间的蛋白-蛋白相互作用。在体外生长抑制效果与TEAD1表达水平成正比（图8b）。小鼠实验也证明了口服K-975可显著抑制肿瘤，从而显著提高总生存期（图8c）。此外，我们检验TEAD抑制与其他分子靶向剂的附加效应。由于YAP-TEAD轴的激活与抗RTK和MEK1/2抑制有关。用不同浓度的MEK1/2抑制剂和K-975进行了类似的实验，在EMT组中，单纯使用MEK1/2抑制剂的效果不太明显。发现MEK1/2抑制剂与TEAD抑制剂的组合策略，以克服MEK1/2抑制剂的耐药性，在EMT组的生长抑制作用；这种作用在TEAD1高表达的细胞系中比在TEAD1高表达的细胞系中更为明显低表达。证实了这两种化合物在EMT组TEAD1高表达的GC细胞株中具有明显的协同作用（图8d）。
图8 EMT组GC中TEAD抑制剂
总结
腹膜转移是胃癌（GC）的主要特征，目前尚无有效的治疗方法。本研究对98例患者的恶性腹水样本及其相应的肿瘤细胞系进行了全面的多组学分析。与原发性GC相比，弥散性腹水GC受体酪氨酸激酶和丝裂原活化蛋白激酶途径的改变频率更高；此外，大约一半的基因改变可以通过靶向进行治疗。本研究还将弥散性腹水GC分为两种不同的分子亚型：其中一个在ELF3、KLF5和EHF基因座上显示活性超增强子（SE），另一个亚型通过SMAD3 SE激活和转录增强子因子TEF-1（TEAD1）的高表达而携带转化生长因子-β（TGF-β）途径激活。在TGF-β亚型中，TEAD通路的抑制规避了治疗耐药性，这表明对于这种难治性GC亚型，其是一种潜在的分子靶向治疗策略。这项研究全面的展示了胃癌与腹膜转移的基因组/表观基因组概况，加深了我们对胃癌细胞生物学的理解，并有助于确定无法治愈的晚期胃癌中的分子靶点。
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