以下文章来源于iProteome ，作者孙明君
本期为大家带来的是悉尼大学Georgina V. Long团队在Cancer Cell上的文章，题为“Multiomic profiling of checkpoint inhibitor-treated melanoma: Identifying predictors of response and resistance, and markers of biological discordance”,研究发现，结合 TMB 和 IFNγ 相关基因表达的多变量模型可稳健地预测应答，其中具有高 TMB 和高 IFNγ 特征的肿瘤显示出对免疫治疗的最佳应答，且该模型在独立队列中得到验证。除了JAK3功能丧失突变，对于没有按预期做出应答的患者，没有明显的生物学机制可以清楚地解释他们的异常状态，这与对免疫治疗的肿瘤内和肿瘤间异质性一致。
撰文 | 孙明君
导言
检查点抑制剂已经彻底改变了晚期黑色素瘤的治疗，以及高风险早期疾病。对于晚期黑色素瘤患者，检查点抑制剂免疫疗法对大量患者有效，在临床试验人群中，联合免疫疗法的5年总生存期高达52%。尽管有这一进展，但由于先天或后天抵抗免疫治疗，大多数晚期黑色素瘤患者依旧因此而死。
目前，对于免疫治疗的耐药机制仍然不清楚。广义上说，有T细胞浸润、程序性死亡配体(PD-L1)高表达和干扰素γ (IFNγ)信号的热肿瘤对治疗有应答，而冷肿瘤(即肿瘤微环境中没有T细胞)没有应答。研究曾报道，通过基因表达数据和多重免疫组化技术在一个大队列中证明了EOMES+CD69+CD45RO+效应记忆T细胞与抗 PD-1联合或不联合抗 CTLA-4治疗的应答有关。其他研究也探索了治疗前肿瘤标本中的突变、基因表达和蛋白表达数据，以识别与免疫治疗应答相关的生物标志物，主要与PD1或IPI单药治疗相关。包括JAK突变、PTEN丢失、抗原递呈损失、WNT/beta-catenin过表达、新抗原异质性、T细胞功能障碍和非冗余信号通路在内的抵抗机制已经被发现。然而，这些事件的发生频率很低，在无应答的患者中是高度不均的。
本研究中，研究者使用治疗前的黑色素瘤组织活检样品，试图在一组大型晚期黑色素瘤患者队列中对PD1以及结合PD1和CTLA-4检查点抑制剂治疗的应答和耐药性情况进行整合分析。研究者使用全基因组测序(WGS)、RNA测序(RNASeq)、甲基组分析和免疫组化(IHC)将来自该患者队列的肿瘤的基因组、转录组、甲基组、和免疫细胞浸润与广泛的应答和其他临床数据关联起来，对新的和先前发表的对治疗应答的生物标志物进行了评估，并探索了可能的耐药机制。
研究结果
研究者收集了77名患有晚期皮肤黑色素瘤的患者治疗前肿瘤活检样本，这些患者在术后接受了单独的 PD1或 PD1 联合IPI治疗。从活检到免疫治疗开始的中位时间为 5.2（范围 0-55.4）月。肿瘤主要来自皮下（56%）和区域淋巴结（30%）；此外，测序还包括原发性肿瘤(4%)和脑转移瘤(9%)。原发性黑色素瘤患者有66（86%）名是出现在非肢端皮肤部位，11 名患有隐匿性原发性黑色素瘤，这些患者被归在皮肤黑色素瘤中，用于后续治疗有效性分析。本队列的患者中位年龄为58岁，51（66%）名患者为男性，55（71%）名属于美国癌症联合委员会第八版M1c/d 亚期，24（31%）名患者乳酸脱氢酶升高，31（40%）名患者的ECOG-PS打分为1或更高。大约一半(n = 35 [45%])的患者未接受过全身治疗，22 (29%)名患者BRAF+/–MEK抑制剂无效, 29 (38%) IPI无效和5 (6%)化疗无效。中位随访时间为35.2（范围 0.2-73.3）月。使用RECIST 1.1前瞻性地测量了对治疗的应答结果。良好应答者（n = 50）定义为RECIST完全缓解（CR）、部分缓解（PR）或疾病稳定（SD）超过6个月；不良应答者（n = 27）的RECIST进展为最佳总体疗效或SD少于6个月。良好应答者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）均相较于不良应答者有较好的改善。与 PD1单药治疗相比，IPI + PD1联合治疗的患者OS和PFS更长，这与 III 期临床试验一致。
所有的样本匹配的种系DNA样本均进行了WGS (n=77)，来自患者亚群的肿瘤接受了RNASeq(n = 53)、使用Illumina EPIC甲基化阵列的甲基化分析(n = 43)和/或IHC(n = 41)。
2、高肿瘤突变负荷、低结构变异负荷和高新抗原负荷与良好的应答相关
研究者对每个样本的体细胞单核苷酸变异(SNV)、结构变异(SV)和拷贝数改变 (CNA) 的总体负担，以及突变特征（例如，紫外线辐射 [UVR] 暴露）和对免疫检查点治疗的应答进行了探究（图1A）。
对任何治疗的总体应答与较高的肿瘤突变负荷 (TMB) 显著相关（图1B）。相反，较差的应答与更多的SV和更高CNA负担的趋势显著相关（图1C, D）。当根据治疗类型（PD1 或 IPI + PD1）进行分析时，仅在PD1应答和TMB，以及IPI和PD1应答和SV计数间看到了显著性；但是整体的趋势是一致的。由于肿瘤来源于多个部位，我们还单独检查了皮下肿瘤（占肿瘤的 56%）的 TMB，并且与之前的观察结果一致，发现与不良应答者相比，良好应答者的TMB显著更高。相反，皮下肿瘤中的 SV 计数在不良应答者中显著升高。对任何治疗来说，高的TMB和低的SV负担都是和PFS改善显著相关的。当将TMB和SV负荷在任何治疗中与PFS一起比较时，对于具有高TMB的肿瘤，无论SV 负荷高或低，他们之间没有显著生存差异。但是，当关注低TMB样品的SV负荷时，会发现有低SV负荷的人的PFS显著改善。当检测基于COSMIC的突变特征时，发现在有无应答与在大多数肿瘤中占主导地位的UVR特征（SBS7a、SBS7b和SBS7c）之间没有关联，但在没有UVR特征的不良应答者中更常检测到SBS38和SBS5。对药物的应答情况与全基因组重复的存在没有关联（图1A）。染色质碎裂和其他复杂的重排事件在应答不良者中更为常见，这与应答不良者中有较高数量SV一致。
关注预测的表达新抗原数量，研究者发现TMB 和表达的新抗原计数之间存在良好的相关性，这与预期一致。由于这种关联，对预测的新抗原负荷较高的患者，其对任何治疗的总体应答都更好；对于任何治疗或单独的 PD1治疗，都看到了这种显著的差异；对IPI + PD1 联合治疗组，则是观察到类似的非显着趋势（图1E, F）。
图1 良好和不良应答者的体细胞突变和表达的新抗原
3、特定基因中没有突变与应答或耐药密切相关
研究者接下来试图评估对治疗的应答是否与特定基因的突变有关。如之前所报道的，研究者发现之前TCGA报道的分子亚型（BRAF、NRAS、NF1和三重野生型）和治疗应答之间并没有显著性（图1A）。为了寻找可能与治疗应答相关的其他突变基因，研究者对 SNV 和小插入缺失进行了全基因组分析。研究者考虑到了TMB并调整了多个测试，但并没有发现基因显示出统计学意义。研究者还探究了之前报道的与治疗应答与耐药相关的基因中的特定突变。基因突变是可变的，与良好或不良应答没有强烈关联，包括来自JAK/STAT、PBAF和β-连环蛋白通路的基因。对IPI + PD1 (MELA_0388)应答不佳的患者有JAK3剪接突变 (c.985-1C > A)，并且JAK3表达低。
4、干扰素和T细胞受体信号通路在应答者中富集，但没有特征与不良应答相关
对 77 个黑色素瘤中的 53 个进行 RNAseq。对于良好和不良应答人群间的差异分析鉴定得到了205个显著基因。正如预期中的，这些基因中有大量的免疫基因是在应答者中上调的，这些基因先前已被证明与免疫治疗反应相关：CD274（编码 PD-L1）、STAT1、IFNG、GZMA、PRF1、GZMB和CD8A。基因富集分析显示，只有IFNγ反应通路在良好应答者中显著富集，而不良应答者中没有显著富集的通路（图2A）。
使用 Illumina EPIC 甲基化阵列在43个黑色素瘤上生成甲基化谱。差异甲基化阵列分析仅从 729,474 个探针中识别出5个甲基化CpG 位点在良好应答和不良应答间有显著差异，这可能是由于肿瘤起源组织的小样本量和可变性。五个差异 CpG 位点中没有一个位于基因启动子中。因此，研究者主要关注了甲基化与205个在良好和不良应答者之间差异表达的基因的关联。有5647个CpG位点被映射到192个差异表达基因上，173个基因中的1671个CpG位点与表达显著相关。其中，127个基因中的568个探针被定位到启动子区域并与表达呈负相关，这里面41个基因具有5个及以上与表达呈负相关的 CpG 位点。对于这41 个基因，研究者重新分析了良好和不良应答者的甲基化，这一次使用与表达相关的 CpG 位点的甲基化中值（β值）并且至少有5个肿瘤具有甲基化（β值 > 0.3)。研究者发现免疫蛋白酶体基因PSMB8，其启动子区域（TSS1500、TSS200、5'非翻译区[5'UTR] 或供应商注释文件中的第一个外显子）中CpG位点的中位甲基化均与表达呈负相关，并且在良好和不良应答者之间有显著差异。据报道，PSMB8的表达与黑色素瘤中更好的预后和对免疫检查点抑制的反应有关。
研究者随后探索了先前报道的与免疫治疗反应相关的几个基因集的表达。这些基因集之间有许多的重叠（图2B），且因为他们很多在良好应答和不良应答者之间差异表达，所以认为其与预后相关，包括六基因的IFNγ信号（IFNγ-6）（图2C）、相关的十八基因的IFNγ信号（IFNγ-expanded immune 18）（图2D）、效应 T 细胞特征（effector T cell）（图2E）、组合的 IFNγ/效应 T 细胞特征（IFNγ-expanded immune 18）（图2D）、趋化因子特征（图2G）和肿瘤免疫功能障碍和排除(TIDE)框架（图2H）。当仅比较皮下肿瘤时，良好应答者的IFNγ打分也是显著高的。
与之相反，研究者没有在良好应答者和不良应答者之间找到β-catenin或(TGF)-β相关的基因，或黑色素瘤可塑性评分(MPS) 或先天抗PD-1耐药性（IPRES）评分表达差异的证据。较长的PFS与IFNγ、效应器T细胞和趋化因子特征的更高表达有关，但与应答者的TIDE预测、β-catenin、TGF-β、MPS或IPRES特征没有显著关联。
图2 黑色素瘤的差异表达基因
5、CD8+ T细胞、M1巨噬细胞和细胞溶解活性定义了应答者的免疫微环境
接下来，研究者研究了免疫细胞标记，以表征免疫肿瘤微环境（图3A）。研究者使用CIBERSORT从表达数据中估计浸润免疫细胞的亚型，发现良好应答者和不良应答者之间存在显著差异，M1巨噬细胞（图3B）和CD8+ T细胞（图3C）在良好应答者中的比例更高。仅在皮下肿瘤中，在良好应答者里评估的CD8+细胞也更高。此外，当使用methylCibersort通过甲基化数据估计免疫浸润时，研究者发现了良好应答者中有更高比例的CD8+ T细胞（图3D）。不出所料，基于表达和甲基化的CD8+ T细胞的评估结果是相关的。基于两个基因PRF1和GZMA的表达量的细胞溶解活性，在CD8+ T细胞激活时上调，在良好应答者中也更高（图3E）。PRF1和GMZA甲基化的综合测量表明，这两个基因的甲基化较低也与良好的应答有关（图3F），但这主要是由于不良应答者中PRF1的甲基化。
高比例的M1巨噬细胞、CD8+ T细胞（来自表达和甲基化数据）和更高的细胞溶解活性与较长的PFS相关。IHC测定的CD8+ T细胞的存在情况也与良好的应答有关（图3G）；特别是CD8在瘤内表达情况(瘤内细胞毒T细胞密度)，在肿瘤周围有更多CD8+细胞的趋势（图3H）。PFS也观察到类似的关联。IHC测定的CD8+ T细胞的存在也与CIBERSORT估计的CD8+ T细胞比例、细胞溶细胞活性和甲基CIBERSORT估计的CD8+ T细胞显著相关。在将这些发现与PD-L1的表达联系起来时，RNAseq（图3I）和IHC（图3J）测出的PD-L1的高表达与良好的应答和更长的PFS有关。之前的研究报道，PD-L1 TSS1500 CpG位点cg197224470的甲基化与黑色素瘤的存活率低有关。虽然本研究中，研究者观察到PD-L1表达和cg197224470 CpG位点的甲基化之间存在显著相关性，但良好和不良应答者的PD-L1甲基化之间或PD-L1甲基化低和高PD-L1甲基化之间的PFS没有显著差异。
图3 黑色素瘤的免疫微环境
6、TMB和IFNγ-6评分是独立的，可以较临床因素更好地预测对免疫治疗的应答
因为TMB、IFNγ-6和CD8+ T细胞都与应答有关，并且由于研究者预计高TMB会诱导高免疫反应，研究者随后研究了TMB如何与IFNγ-6和CD8+ T细胞相关。正如其他人所报告的那样，TMB与IFNγ-6或CIBERSORT估计的CD8+ T细胞比例在此队列中无关，这表明它们是独立的预测因素。
为了进一步证实这一点，研究者建立了回归模型，使用53名具有完整分子和临床数据的患者来预测应答。首先，研究者基于分子标记（TMB、SV负担、肿瘤纯度、前面提及的几种表达特征、细胞溶解活性和CD8+细胞密度）和临床因素（之前接触的BRAF/MEK抑制剂或IPI、组织收集和开始治疗之间的时间间隔、乳酸脱氢酶、年龄、性别、单一疗法或联合免疫治疗）以及肿瘤负担构建了单变量模型。由于TMB是最强的单变量预测器，研究者接下来使用TMB和单变量分析中每个剩余的重要因素构建了双变量模型。所有基于TMB和任何IFNγ或T细胞表达特征的模型都表现出类似的预测性能，基于TMB和IFNγ-6评分的模型给出了最准确的预测，确认它们是独立的预测因素。两个因素每个都预测了对免疫治疗的反应（IFNγ-6 AUC，0.76；TMB AUC，0.79），但结合时对应答的预测性更高（AUC，0.84；灵敏度，89%；特异性，53%）（图4A和5A）。因此，高TMB和高IFNγ-6的肿瘤对免疫治疗应答最好，并与较长的PFS（图4B）和较长的OS（图4C）有关。
在确定TMB和IFNγ-6可以独立预测应答后，研究者试图测试该结果是否可以重现，并从60名黑色素瘤III期患者的独立队列中获得了数据。两名患者因肿瘤/正常配对QC失败而被排除在外。为了使该队列与全外显组数据和本研究中的全基因组数据进行比较，研究者使用IFNγ-6分数和非同名TMB对数据进行了双变量回归模型。虽然两队列的疾病阶段和治疗背景（非辅助治疗的III期黑色素瘤）不同，但双变量模型能够预测验证样本的应答，其准确性与训练样本相当（AUC，0.79；敏感性，80%；特异性，59%）（图4D和5B）。
图4 TMB和IFNγ相关基因预测应答和PFS
7、应答与预期不同的生物学上不一致的肿瘤的分析
随后，研究者对12名患者进行了临床和分子检查，这些患者没有通过TMB/IFNγ-6得分的双变量模型（图5A和5C）正确预测，以深入了解潜在的特定耐药性机制或预测耐药性的应答。八名患者被预测会有反应，但应答结果很差（图5A和5C），其中7名患者接受了PD1单一疗法，但与正确预测的应答者没有明显的共同分子特征（图5C）。第八名患者（MELA_0388）具有潜在的耐药性生物学机制，JAK3剪接突变（和低JAK3基因表达），这已经被证明可以消除细胞因子对免疫细胞的刺激。八名患者中有四名被认为TMBhiIFNγ-6lo，四名患者为TMBloIFNγ-6hi（根据中位数定义）。后者都在2.2个月内进展，并且其中三个在肿瘤中没有PD-L1表达（具有可变的肿瘤浸润淋巴细胞[TIL]或细胞溶解活性），这可能解释了这几个患者抗PD-1治疗的先天耐药性。与四名进展迅速的患者不同，四名TMBhiIFNγ-6lo患者进展较慢，在2.7个月至5.5个月之间。其中三名患者患有促纤维结缔组织增生性恶性黑色素瘤（MELA_0608、MELA_0413和MELA_0430），此前据报道，由于其高TMB，他们对免疫检查点抑制剂反应良好。还有四名预计没有应答的患者，但应答良好（MELA_0441、MELA_0366、MELA_0383和MELA_0552）（图5A和5C）。这四人都为TMBloIFNγ-6lo，并在初始反应后出现后天性耐药。其中三个是未经治疗的，这与训练集（n = 53）中发现的BRAFi/MEKi-naive患者相比应答明显更好。
图5 用于单变量和多变量分析的连续变量和二元变量的分布
总结
在这项对77例仅使用PD1或IPI + PD1治疗的转移性黑色素瘤患者的研究中，研究者发现许多与应答相关的因素。研究者还发现了许多与低响应相关的因素，即大量的结构重排和本地化的复杂事件如染色体碎裂、以及高PSMB8启动子甲基化。此外，研究者结合了IFNγ和TMB的模型，对反应具有高度预测性（灵敏度为89%），但没有预测耐药性（特异性为53%），并在一个独立的队列中进行了验证。一个关键的未满足的需要是在癌症免疫治疗识别患者谁将是耐药性，以便将注意力集中在提供替代治疗策略上。异质性是这一成功的最大障碍。解决方案是通过个性化治疗，对患者进行个性化的方法识别耐药性并确定治疗操纵的机制。通过结合多病变分析和单细胞测序探索独特的异常值，我们可能会获得个人见解到生物学的耐药性。
原文引用 | https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.11.012
转自：“医科研”微信公众号
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