引用文献：Xia Wenwen., Hu Shoushan., Wang Mengmeng., Xu Fan., Han Lan., Peng Daiyin.(2021). Exploration of the potential mechanism of the Tao Hong Si Wu Decoction for the treatment of postpartum blood stasis based on network pharmacology and in vivo experimental verification. J Ethnopharmacol, 268(undefined), 113641. doi:10.1016/j.jep.2020.113641
背景：桃红四物汤为调经要方之一，是《玉机微义》转引的《医垒元戎》中的一个方子，也称加味四物汤，桃红四物汤这一方名始于见《医宗金鉴》。该方由四物汤加味桃仁、红花而成，功效为养血活血。现代研究表明，桃红四物汤具有扩张血管、抗炎、抗疲劳、抗休克、调节免疫功能、降脂、补充微量元素、抗过敏等作用。THSWD是治疗产后血瘀病的常用处方。本文旨在利用网络药理学和实验研究探讨THSWD治疗产后血瘀的潜在机制
方法与结果
网络药理学
1.成分及靶点获取
使用ADME系统（OB>30%，DL>0.18）在TCMSP数据库中对桃红四物汤（THSWD）的活性成分进行筛选搜集文献资料进行补充，总共获得69个活性成分，白芍13、地黄2个、当归2、川芎7，桃仁23，红花22。它们都具有良好的生物活性，例如，地黄、当归中存在豆甾醇（MOL000449，OB:43.83%，DL:0.76）。豆甾醇作为一种天然类固醇，具有很强的免疫调节作用。减轻LPS诱导的小鼠先天性免疫反应并保护模型小鼠免受器官损伤。芍药苷（MOL001924，OB:53.87，DL:0.79）是白芍的主要活性成分之一。它有许多功能，包括抗炎、免疫调节等。它治疗多种疾病炎症性疾病。芍药苷在溃疡性结肠炎中发挥抗炎作用抑制小鼠MAPK/NF-κB通路和细胞凋亡。
此外，我们使用TCMSP、DrugBank数据库收集THSWD中潜在活性成分的靶点并使用UniProt数据注释靶基因。共获得207个靶基因，这些靶点有自己的途径在不同疾病中发挥治疗作用。例如，黄芩素（MOL002714，OB:33.52，DL:0.21），一种红花的潜在活性成分Flos，作为孕酮受体（PR）拮抗剂和糖皮质激素受体（GR）兴奋剂。黄芩素与这两种受体结合时，构象特异性很小，且具有大致的特异性两种受体的结合亲和力相同。黄芩素可同时具有这两种作用益处：通过GR减少炎症，通过干扰雌激素和孕酮作为PR拮抗剂的平衡。
2.THSWD和产后血瘀的共同靶点
为了证实THSWD对产后血瘀有良好的治疗作用，我们利用各种数据库和数据库（GeneCards、OMIM、）收集了623个不同的产后血瘀症靶基因207个THSWD靶基因。通过交叉，我们获得了105个共同的靶基因如图1所示。图1a表明疾病基因与白芍、地黄、当归、川芎根茎的基因交叉。图1b显示了疾病基因与桃仁、红花的靶基因的比较。桃仁和红花具有较高的常见靶点优于四物汤，对产后血瘀有重要作用。每种草药和它们所扮演的疾病之间都有不同数量的共同目标从不同方面对产后血瘀病的治疗作用，包括一氧化氮在血管舒张、炎症和氧化应激中起关键作用的氧化物合酶（NOS），主要通过活性氧（ROS）的产生。由PTGS2基因编码的前列腺素合成酶环氧化酶-2（COX-2）是前列腺素合成中的限速酶，因此在前列腺素合成中起着独特的调节作用炎症。
3.PPI网络分析
利用PPI网络，探索了不同靶基因之间的关系为后续路径分析提供了基础。这些蛋白质基因之间的已知相互作用数据来源于管理数据库，并通过实验确定。预测的相互作用包括基因邻域、基因融合和基因共现。此外，还有其他来自文本挖掘、共表达和蛋白质同源性的相互关系（图2a）。由104个靶基因和411个相互作用组成的自由靶标，我们计算不同靶基因与其他基因之间的相互作用数。图2b显示了前30个交互节点基因的数量。这些靶基因的数量与其他靶基因的相互作用是不同的，例如IL-6（白细胞介素-6，41）、ALB（白蛋白，39）、VEGFA（血管内皮生长因子A，36）、PTGS2（前列腺素G/H合酶2，31）、JUN（转录因子AP-1，29）和CAT（过氧化氢酶，28）。
4.药物-成分-靶点-疾病网络图
为了更直观地了解THSWD的治疗机制在产后血瘀证的治疗中，我们构建了中药成分靶向疾病网络（图3）。在几种草药和靶标之间重复的潜在活性成分与之相对应的是，两者在绘图时均被删除，因此在此网络中有39个活性成分和51个靶点。结果表明，THSWD中草药的一种成分作用于多个目标。例如，白芍中的芍药苷具有靶点白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、单核细胞分化抗原CD14和脂多糖结合蛋白，从而发挥潜在的治疗作用。
5.GO功能富集分析
疾病的发生与药物的治疗是多角度上相互作用的动态过程，包括DNA损伤、基因突变、细胞周期行为、种群动态、炎症、代谢免疫平衡等。探索动态在产后出血性疾病的THSWD过程中，我们使用R语言GO来丰富105个共同目标的GO生物过程。我们使用统计p和q值小于0.05进行过滤。GO富集分析结果包括不同的生物过程、分子功能和细胞成分。其中包括top10生物过程如下：辅因子结合（GO:0048037）、血红素结合（GO:0020037）、四吡咯结合（GO:0046906）、氧化还原酶活性、作用于成对供体、结合或减少分子氧（GO:0016705）、类固醇结合（GO:0005496）、整合素结合（GO:0005178）、抗氧化活性（GO:0016209）、单加氧酶活性（GO:0004497），生长因子结合（GO:0019838）和Hsp90蛋白结合（GO:0051879）。RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合（GO:0000978）、近端启动子序列特异性DNA结合（GO:0000987）、类固醇激素受体活性（GO:0003707）、羧酸结合（GO:0031406）和雌激素受体结合（GO:0030331）是top5分子功能。同时，我们发现GO富集分析也显示了细胞组成的显著差异。核受体活性（GO:0004879）、细胞粘附分子结合（GO:0050839）、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性（GO:0004714），跨膜受体蛋白激酶活性（GO:0019199）和细胞外基质结合（GO:0050840）是top5 GO富集物蜂窝组件。图4显示了前20个重要的富集结果。
6.THSWD治疗产后血瘀的KEGG分析
为了从通路水平解释产后血瘀的治疗机制，一个完整的“产后血瘀通道”被构建。路径富集分析提供了有关基因功能及其相互作用的进一步信息。KEGG富集分析显示共有68条途径存在显著差异（P<0.05）。这个top10富集途径是糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（hsa04933），流体剪切应力和动脉粥样硬化（hsa05418），HIF-1信号通路（hsa04066）、雌激素信号通路（hsa04915）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（hsa05167）、癌症中的蛋白多糖（hsa05205）、PI3K Akt信号通路（hsa04151），人巨细胞病毒感染（hsa05163），TNF信号通路（hsa04668），MAPK信号通路（hsa04010）。富集度最高的前20个途径项因素如图5所示。这些通路与血瘀病密切相关。这个晚期糖基化终产物（AGE）和AGE受体（RAGE）信号通路通过对动脉硬度的影响调节心血管疾病的发病机制，动脉粥样硬化、线粒体功能障碍、氧化应激、钙稳态和细胞骨架功能。AGEs和其他配体与其受体、RAGE、局部包括胎膜在内的多种组织，但主要在内皮和血管中壁细胞。年龄的积累在慢性高血糖症或氧化应激，如糖尿病。年龄也与AGEs受体（RAGE）和激活NADPH氧化酶（Nox）和核因子κB（NF-κB），从而引发氧化应激和炎症的恶性循环。缺氧可能参与血管壁各种疾病的发病机制，低氧诱导因子（HIF）是调节转录的核转录因子在调节细胞和组织对氧合改变的稳态反应的基因中HIF-1α可能通过改变平滑肌细胞增殖而导致动脉粥样硬化迁移、血管生成和脂质代谢。通过分析这些途径，THSWD主要在产后血瘀中发挥治疗作用疾病从四个方面入手，包括抗炎免疫、减少出血、促进子宫内膜再生，抗氧化应激。
体内实验
1.改善子宫组织线粒体损伤
我们通过观察THSWD对产后血瘀大鼠子宫组织的影响检测线粒体结构（图6A）。结果表明，大鼠脑组织中的线粒体对照组子宫组织细胞呈卵圆形，线粒体基质致密，嵴完整，排列和结构正常。线粒体不规则，肿胀明显，嵴排列紊乱，轮廓和线粒体不清基质呈半透明空泡状，提示子宫内膜线粒体结构产后血瘀大鼠的组织细胞被破坏。治疗组线粒体肿胀减轻，基质密度增加，嵴排列整齐有一小部分坏了。线粒体结构基本恢复到正常水平对照组与模型组比较。接下来，我们检测了大鼠子宫组织中线粒体ATP含量的变化。这个结果表明，与对照组大鼠相比，小鼠体内产生的ATP量模型组大鼠子宫组织中的线粒体显著减少，表明模型组大鼠子宫组织的线粒体功能降低（图6B）。给药后，THSWD高剂量组能够显著改善子宫组织中线粒体产生的ATP量。最后，我们研究了子宫内膜线粒体呼吸链复合物的活性产后血瘀大鼠的组织细胞。呼吸链是一个连续的反应系统由一系列氢转移反应和电子转移反应组成一定的顺序。从代谢物中去除成对的氢，并将其给予氧气以产生水，同时产生ATP。事实上，呼吸链的作用代表了线粒体的基本功能。我们检测了子宫内膜线粒体功能的变化通过检测线粒体呼吸链复合物I和IV的活性来检测组织。如图所示在图6C和D中，与对照组相比，线粒体呼吸系统的活性链复合物I和IV不同程度地减少，呼吸链复合物I为在大鼠子宫组织中最显著。给药7天后，高剂量THSWD组和LG组显著增加线粒体复合物的活性，而THSWD低剂量组变化无显著性差异。
图6 线粒体超微结构图像的透射电镜图像。对照：线粒体呈椭圆形，线粒体基质致密。模型：线粒体不规则肿胀，线粒体基质半透明，空泡状。THSWD 18 g/kg：线粒体呈椭圆形，脊排列整齐。THSWD 9 g/kg：线粒体轮廓清晰，线粒体基质中部仍为半透明。THSWD 4.5 g/kg：线粒体轮廓清晰，线粒体基质半透明，空泡状。Lg 7.5 g/kg：线粒体呈椭圆形，线粒体基质致密，脊完整。（500nm）(a)；产后血瘀大鼠子宫组织ATP含量的测定(b)产后血瘀大鼠子宫组织线粒体呼吸链复合物I和IV的活性（C，D）。数据表示为平均值±SD。n=10。与对照组比较：*p<0.05；与Model Group比较：p<0.05。
2.THSWD调节产后血瘀大鼠的氧化应激
观察产后血瘀大鼠给药THSWD后氧化应激的变化及调节，检测各组产后血瘀大鼠血液中的ROS、SOD和谷胱甘肽（GSH）。测试了谷胱甘肽过氧化物酶的水平（如图7所示），并与模型的水平进行了比较。THSWD高剂量组和中剂量组的ROS水平显著降低，而THSWD高、中剂量组的SOD、GSH和GSH-Px水平分别为显著增加。这些发现表明模型大鼠的氧化应激水平组的氧化水平相对较高且不平衡，这对患者的预后产生不利影响治疗疾病和组织恢复后，THSWD恢复了不平衡的氧化水平和促进子宫恢复。核因子红系2相关因子2（Nrf2）是一种重要的转录因子抗氧化应激途径。研究表明，随着活性氧（ROS）的增加，活性氧的激活核因子Nrf2在细胞核中被诱导，Nrf2结合活性迅速增强增加（Moritani等人，2017年；Ye等人，2015年），与细胞中的抗氧化反应结合多种抗氧化基因的启动子区。调节基因转录的元件，如γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和血红素加氧酶1（HO-1），从而调节其氧化损伤的蛋白质表达（Chuang等人，2015）。我们使用Western blot分析检测Nrf2、HO-1和γ-GCS蛋白在大鼠子宫组织中的表达，并重复上述步骤测定三次。如图7所示，Nrf2、HO-1和γ-GCS蛋白的表达模型组与对照组相比略有增加，这可能是由于组织处于氧化应激状态，其中氧化防御和Nrf2途径激活。与模型组相比，治疗组的Nrf2、HO-1和γ-GCS水平升高。结果表明，THSWD可以通过调节氧化应激损伤来减轻氧化应激损伤Nrf2途径，增加相关蛋白HO-1和γ-GCS的表达，并释放下游解毒酶。
图7 大鼠血清ROS(a)，SOD(b)，GSH(c)，GSH-Px(d)含量，以及Western blot(e)，nRF2(f)，HO-1(g)，GCS(h)水平图。1.Control Group 2。模型组3。THSWD低剂量组4。THSWD中剂量组5。THSWD高剂量组6。益母草颗粒阳性对照组。数据表示为平均值±SD。n=10。与正常组比较，*p<0.05**p<0.01；与模型组比较，p<0.05 p<0.01。
3.子宫组织凋亡减少
TUNEL方法检测凋亡细胞，并且可以有效地确定总体子宫组织的凋亡水平。TUNEL方法用于检测凋亡细胞（图8）。结果表明，模型组凋亡细胞数量最多，高剂量治疗组的凋亡细胞数量显著减少。结果表明产后血瘀大鼠具有高水平的凋亡，THSWD具有一定的抗凋亡作用影响。
图8 TUNEL法细胞凋亡试验结果大鼠子宫组织，正常细胞（红箭头），凋亡细胞（绿箭头），坏死细胞（黄箭头）（X400）。对照组(A)；模型组(B)；THSWD高剂量组(C)；THSWD中剂量组(D)；THSWD低剂量组(E)；LG组(F)。各组大鼠子宫组织凋亡数(G)。数据表示为平均值±SD。n=10。与正常组比较*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较#p<0.05，##p<0.01。
结论
为了探讨THSWD治疗产后血瘀病的机制，提取了THSWD中的69种潜在活性成分及其207个靶标。同时使用多个数据库筛选了623个疾病靶点。共找到105个共同靶点。PPI网络和GO富集分析表明这些共同的靶基因之间存在多重相互作用。GO富集分析所有靶基因的功能分为三大类：分子功能、生物过程和细胞部位。最后，从四个方面分析了所有途径的整合：抗炎免疫，促进子宫收缩并减少出血，修复子宫内膜和抗氧化应激。在抗炎免疫方面，当归中的β-谷甾醇，白芍中的芍药苷和红花中的槲皮素作为有效成分起到了重要作用。它们通过IL-6、PTGS2、JUN、CASP8和其他靶点共同作用于TNF信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号通路等经典抗炎免疫途径发挥作用。通过KEGG通路分析发现，熟地作为THSWD比例最大的药物，在抗炎和抗氧化应激途径中没有显示出最佳疗效。豆甾醇是地黄的常见成分主要作用于α-1a靶点的白芷和当归肾上腺素能受体（ADRA1A）、胺氧化酶[含黄素]a（MAOA）、PTGS1和这些靶点主要集中在色氨酸代谢、钙信号传导与花生四烯酸代谢有关，这些途径可以抑制出血并调节免疫因此，我们推测地黄是治疗本病的主要药物产后血瘀时减少子宫出血，调节免疫力。根据其靶点，豆甾醇是熟地和当归的常见成分，主要作用于α-1a肾上腺素能受体（ADRA1A）、胺氧化酶[含黄素]a（MAOA）、PTGS1和PTGS2的靶点。这些靶点主要集中在色氨酸代谢、钙信号通路和花生四烯酸代谢，这些途径可以抑制出血并调节免疫。因此，我们推测地黄是产后血瘀证中减少子宫出血、调节免疫力的主要药物。根据通路靶点，THSWD中的六种草药在子宫修复方面都显示出类似的效果。川芎中的肉豆蔻酮、天竺葵碱和水曲柳内酯、白芍中的芍药苷、地黄中的豆甾醇、当归中的β-谷甾醇、桃仁中的樟脑甾醇和红花中的β胡萝卜素共同作用于VEGFA、KDR、PTGS2和NOS3。它们可以调节VEGF信号通路，促进子宫修复。在抗氧化应激方面，通过追踪富集途径发现白芍和红花的活性成分起着关键作用。其中白芍中的山奈酚和芍药苷、槲皮素、黄芩素、β-胡萝卜素和红花中的木犀草素共同作用于IL6、NOS2、JUN、HMOX1、ICAM1、SELE、VCAM1、INSR、HIF1A等靶点。当归、川芎、桃仁对君、NOS2等靶点起到辅助作用，这也从侧面证明了添加桃仁、红花可以与四物汤一起发挥调节作用，以及THSWD的科学配伍对产后血瘀的治疗作用。根据上述研究，对THSWD在治疗产后血瘀中的抗氧化应激进行了更深入的研究，发现线粒体的损伤与之密切相关。在体内实验中，证实THSWD显著减少了线粒体损伤，增加了Nrf2和下游蛋白HO-1和γ-GCS的水平，从而降低了产后血瘀大鼠子宫组织细胞的氧化应激水平和凋亡。由于THSWD是治疗产后血瘀的有效处方，因此更好地了解THSWD与产后血瘀之间的关系可能有助于揭示THSWD信号调节的潜在机制。在本研究中，发现THSWD通过活性成分和靶点以多种方式调节产后血瘀。并从抗氧化应激的角度研究其作用机制。作为治疗产后血瘀病的有效方剂，充分了解THSWD的作用机制，为开发THSWD新药和治疗产后血淤病提供了可行的策略。
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