山东省农业科学院作物所利用基因编辑创制新的小麦不育系

随着世界人口的日益增多，到2050年，世界粮食产量需要增产60%以上。小麦是世界上种植范围最广和最重要的粮食作物之一，每年为人类提供20%的热量和蛋白。因此，迫切需要大幅度提高小麦的产量。杂交小麦在丰产、稳产和抗逆等方面综合表现明显，其杂种优势约为3.5-20%。因此，利用杂交育种技术创制杂交小麦是提高小麦产量的有效途径之一。目前，小麦细胞核雄性不育种质资源匮乏，已经克隆的控制细胞核雄性不育的基因还非常的少，因此寻找新的控制小麦细胞核雄性不育的基因就变得尤为重要。

近日，山东省农业科学院作物研究所李根英研究员领衔的小麦分子育种创新团队在《Plant Biotechnology Journal》杂志上发表了题名“CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of TaDCL4, TaDCL5 and TaRDR6 induces male sterility in common wheat”的研究论文。该研究选取了小麦雄蕊发育相关phasiRNA路径中的三个关键基因TaDCL4、TaDCL5和TaRDR6，利用农杆菌介导的CRISPR/Cas9系统对小麦Fielder受体其进行精准打靶，获得了小麦雄性不育突变体，通过对这些突变体的小分子RNA测序，发现这三个基因参与了phasiRNA的产生过程，并阐明了其造成花粉败育的原因。这为小麦细胞核雄性不育提供了新的基因资源。

PHAS (phasiRNA producing genes)转录本含有miRNA的识别位点，单链的PHAS前体在miRNA的介导下被RISCs切割后通过RDR6 (RNA Dependent RNA Polymerase 6)的作用形成双链，这个双链RNA又经DCL4 (DICER-LIKE4)或者DCL5 (DICER-LIKE5)切割产生头尾相连按相位依次排列的21-nt或24-nt的phasiRNA (图1）。这些phasiRNA与AGO蛋白结合后，以顺式或者反式的方式作用于下游的靶位点。

图1. 小麦phasiRNA的产生过程。

在前期的研究工作中，通过对小分子RNA测序数据的分析，我们在雌雄蕊分化期和四分体期的小麦幼穗中鉴定到了大量的21-nt和24-nt phasiRNA，这说明phasiRNA可能在小麦的生殖发育过程中发挥重要的作用。为探讨它们的功能，我们选取了phasiRNA合成路径中的关键基因DCL4、DCL5和RDR6，利用基因编辑成功创制了它们的突变体。

在小麦中，DCL4基因有三个拷贝，分别位于chr2A、chr2B和chr2D染色体上。只有同时突变掉这三个部分同源基因，dcl4突变体才会表现出雄性不育的表型，即花药瘦小，花粉粒少，碘化钾染色后呈黄色。此外，除雄性不育外，dcl4突变体的植株矮小，穗子变小（图2）。RDR6基因在小麦中只有两个拷贝，位于chr3B和chr3D染色体上。当两个部分同源基因的编辑效率同时达到75%以上时，rdr6突变体表现出约一半分蘖可育，一半分蘖不育（图2）；当编辑效率接近100%时，种子萌发率变低，萌发出来的突变体分蘖数偏多并将终生处于幼苗期。DCL5基因在小麦中有三个拷贝，位于chr1A、chr1B和chr1D染色体上。DCL5-1B的DEAD结构域偏小，并且不含Helicase_C和Dicer_dimmer这两个结构域。当DCL5-1D突变率达到70%以上时，dcl5突变体表现出雄性不育的表型。除此之外，在dcl5突变体中未观察到其他的不利农艺性状（图2）。因此，DCL5基因是创制小麦细胞核雄性不育种质资源的候选基因。

图2. 小麦dcl4、dcl5和rdr6突变体的表型。

通过对减数分裂期花粉母细胞的染色体压片，发现在dcl4 和 rdr6 小麦突变体中，均只有部分花粉母细胞可以通过减数分裂过程，因此可观察到的成熟花粉粒较少。在减数分裂的配对和染色体排列在赤道板上这两个时期，dcl4 突变体的个别染色体发生滞后，并在二分体和四分体时期，出现多核现象，最终导致细胞分裂的异常（图3）。rdr6 突变体主要表现为二分体和四分体分裂时细胞间有黏连，不能彻底分离（图3）。dcl5 突变体的减数分裂过程正常，但当四分体分化为小孢子后，在小孢子出现萌发孔后，开始变得异常，最终也不能发育为成熟的小孢子，此外有部分小孢子出现了俩个萌发孔（图3）。

通过对小麦幼穗期的小分子RNA测序，发现dcl4突变体中未检测到21-nt phasiRNA，dcl5突变体中未检测到24-nt phasiRNA，而rdr6突变体中只检测到少量的21-nt和24-nt phasiRNA（图3）。这说明在小麦中DCL4和DCL5分别参与了21-nt和24-nt phasiRNA的产生，而RDR6同时参与了二者的产生过程。通过靶基因预测，发现phasiRNA可以靶向编码和非编码RNA。有些phasiRNA的靶基因，功能主要富集在了减数分裂过程，比如微管的移动、核和染色质的甲基化修饰等；而有些靶基因则参与绒毡层的分化，花粉壁的发育，以及孢粉素（小孢子和花粉外壁的主要成分）的代谢过程。

图3.小麦dcl4、dcl5和rdr6突变体中，花粉母细胞的减数分裂和小孢子的产生过程异常，21-nt和24-nt phasiRNA的产生异常。

通过与水稻基因组比较，发现只有约1.47% 21-PHAS位点和4.99的24-PHAS位点能够比对到水稻基因组上。这说明PHAS位点在禾谷类物种中保守性很低。通过与小麦祖先种AA、AABB、DD和BB基因组的比较分析发现，有多于60%的来自各亚基因组上的PHAS位点可以比对到祖先种的基因组上，但它们在小麦的各亚基因组间却具有非常低的保守性，这说明PHAS位点在六倍体小麦合成之前就发生了高度的分化。

山东农业科学院作物研究所李根英博士和李玉莲博士为论文的共同通讯作者，张荣志博士和张淑娟博士为该文共同第一作者，中国农业科学院作物科学研究所的耿帅锋博士作为作者之一，也参入了本研究。该研究由山东省农业良种工程、国家自然科学基金、山东省重点研发计划（重大科技创新工程）和山东省泰山青年基金的资助。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.14000

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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