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一种新型双活性PNP家族蛋白PRpnp赋予柑橘类作物多重胁迫耐受性

2023/1/13 13:36:44  阅读:143 发布者:

田间作物在自然环境下生长时,经常会面临各种生物及非生物的胁迫,导致投入成本增加,产量降低,带来很大的经济损失。因此,耐胁迫的作物新品种的开发一直都是势在必行的趋势。植物在长期的进化过程中也发展出了自身的一套复杂的免疫防御系统分泌蛋白质以应对不利条件。柑橘是主要的水果作物之一,包括许多具有经济重要性的物种。

最近一种新的PNP家族蛋白刺梨嘌呤核苷磷酸化酶(PRpnp)被发现,是胰蛋白酶的竞争性抑制剂。研究表明,PRpnp过表达上调了ABAJA生物合成和信号传导、植物防御、生长和发育相关的差异表达基因(DEG),并抑制昆虫肠道中的胰蛋白酶,被看做开发抗多种胁迫新品种的潜在候选者。

近日,国际著名杂志Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“PRpnp, a novel dual activity PNP family protein improves plant vigor and confers multiple stress tolerance in Citrus aurantifolia”的研究文章,该研究通过在柑橘中过度表达了PRpnp,显著增强了转基因植物对盐、氧化应激、碱性pH、干旱和两种害虫的耐受性。

1PRpnp定位于细胞核和细胞

该研究在烟草叶片中瞬时表达了PRpnp-GFP融合蛋白,在细胞核和胞浆中检测到PRpnp-GFP蛋白的绿色荧光信号。PRpnp蛋白的表观分子量(MW)为~34kDapI值对应于5.44。(图1

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2)转基因柑橘的鉴定

选择PRpnp作为过表达靶标,并使用农杆菌介导的转化方法来转化研究其防御作用。通过Western blot分析标记其在柑橘中的表达。胰蛋白酶抑制活性测定为胰蛋白酶抑制百分比(I%)。转基因植物A2A6A11的抑制率分别为68.41%56.54%48.41%PNP和胰蛋白酶抑制活性的存在证实了PRpnp在转基因C中的功能。

3)转基因柑橘叶盘衰老试验显示出对多种生物胁迫的耐受性

选择具有可变PRpnp表达水平的六个转基因植物A2A6A11A28A30A32进行叶盘衰老测定。结果证明了PRpnp过表达在转基因植物中提供多重胁迫抗性方面的有用性。(图2

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4PRpnp的过度表达也在整个植物水平上提高了对高盐浓度的耐受性

该研究为了进一步验证PRpnp在整个植物水平上的胁迫响应作用,用75mM NaCl处理WT并选择转基因柑橘A17A19A21 45天。将野生型和转基因植物的叶片用于叶盘衰老和其他离体叶片测定。并且使用不同的植物来评估整个植物的耐盐性和抗旱性。结果表明,与WT相比,转基因植物对盐胁迫具有耐受性,没有明显的盐诱导叶片损伤、高脯氨酸含量和低MDA水平的迹象。因此,PRpnp的过度表达显著减轻了转基因C中盐胁迫的有害影响。(图3

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5PRpnp的过度表达提高了对干旱的耐受性

为了检验PRpnp在调节干旱胁迫耐受性中的作用,对WT和转基因柑橘浇水,A22A24A25被抑制25天。干旱期间A22A24的新叶发育表明,其生长和代谢速率优于WT。在重新浇水后,WT恢复较差;然而,转基因植物迅速恢复活力。WT植物的表型与PRpnp过表达植物在相同胁迫条件下的表现相反,支持PRpnp在干旱反应中的积极作用。通过脯氨酸、MDA和相对含水量(RWC)的定量进一步验证了这一点。结果表明PRpnp过表达增强了转基因C的耐旱性。(图4

6PRpnp的过度表达赋予了对螨蛾幼虫的抗性

由于PRpnp还具有蛋白酶抑制活性,该研究为验证它可以促进害虫抗性,将三种转基因植物A2A6A11的叶片攻击五只二龄幼虫,并与对照组进行比较。研究结果表明,在枳壳植物中PRpnp基因的过表达提高了对螨蛾的抗性。(图5

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7PRpnp的过度表达促进了对成年柑橘蓟马的抗性

该研究通过研究PRpnp对另一种害虫成年柑橘蓟马的杀虫特性,进一步扩展了研究。与对照相比,成年柑橘蓟马在转基因植物上的存活率降低,证实了PRpnp在柑橘中过度表达的优势。(图6

8)在野生型和PRpnp转基因柑橘对照条件下,从头转录体谱分析具有高度的高纯度和高有效性,并具有显著的差异性(DEG

结果表明即使没有胁迫信号,转基因植物中与植物防御、生长和发育相关的基因表达也显著上调,这表明了与WT相比,转基因植物更能适应不利环境条件的原因。

9LC/MS-MS分析证实了PRpnp转基因植物内源ABAJACK的较高积累

在分析转录组数据后,发现与ABAJA生物合成和信号通路相关的基因已经上调。PRpnp似乎可以提高ABAJA相关基因的表达,从而促进它们的共同积累和协同作用。也可能通过调节其相互转化和促进C K游离碱的积累而参与C K代谢。(图7

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这项研究中,在柑橘中组成性地过表达了一种新的PNP家族蛋白PRpnp,并获得了对各种非生物和生物胁迫具有增强耐受性的转基因植物。结果表明,PRpnp的过表达增强了转基因植物的胁迫耐受性的机制,包括增加ABAJA的内源性水平并促进它们的协同作用。并且发现了PRpnp的其他重要功能,包括维持细胞内嘌呤库、CK稳态和提高植物活力。

 原文链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.13989

转自:“植物生物技术Pbj”微信公众号

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