北苍术Atractylodes chinensis (DC.) Koidz.为菊科苍术属多年生草本植物，入药部位为根茎，有燥湿健脾、祛风散寒等功效，是《中国药典》2020年版苍术药材正品来源之一[1]。苍术的主要活性成分为苍术素、苍术酮和β-桉叶醇等挥发性成分，分为倍半萜类和聚乙烯炔类，具有抗溃疡和抗菌、抗炎等药理作用[2-3]。古代记载苍术的炮制方法有麸炒、醋炒、酒炒、米泔浸等，苍术经过米泔水炮制能缓和燥烈之性、增强健脾作用[4]。脾虚泄泻是脾阳气虚而致运化失常，多表现为腹泻、久泻不愈等。研究发现，腹泻与肠道菌群密切相关，肠道菌群可参与人体多种生理活动，良好的肠道菌群环境能够保证机体各项功能正常发挥[5-6]。近年来，利用中药恢复肠道内微生态环境来治疗腹泻的方法得到推崇。目前已有研究表明，苍术经米泔水炮制后，可提高其健脾和胃、利尿、调节胃肠功能与分泌的治疗作用[7-8]。课题组前期已优选出米泔水制北苍术最佳炮制工艺（米水比例为1∶60，米泔水用量25 mL，闷润2 h，炒制温度160 ℃，炒制时间30 min），并建立了脾虚泄泻症大鼠模型（20 mL/kg ig 200%大黄水煎液，早晚各1次，造模10 d）[9]。尚未发现国内研究米泔水制苍术对大鼠肠道内真菌物种组成结构及丰度的影响，因此，本研究在此基础上采用气相色谱串联四极杆质谱仪联用技术（GC-MS）和HPLC法对北苍术米泔水炮制前后的化学成分进行对比分析，利用ITS高通量测序技术探究北苍术生品及其米泔水制品对大黄所致脾虚泄泻模型大鼠肠道内真菌物种组成及丰度变化的影响，并对差异菌属与化学成分进行Pearson相关性分析，建立肠道真菌-活性成分相互作用关系，为扩大米泔水制苍术的临床应用提供理论参考。
1仪器与材料
1.1仪器
TRACE 1310型气相色谱仪、TSQ 8000 Evo型三重四极杆气质联用仪，赛默飞世尔科技公司；LC-1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；AL104型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多集团。
1.2材料与试药
北苍术药材（批号20200206）购买自河北省安国市荣华本草中药材有限公司，经长春中医药大学翁丽丽教授鉴定为菊科植物北苍术A. chinensis (DC.) Koidz.的干燥根茎。米泔水制北苍术参考2020版《吉林省中药饮片炮制规范》米泔水制苍术项下炮制方法及课题组前期研究成果制备[9-10]；对照品苍术酮（批号P11M10F73437，质量分数97.3%）、白术内酯II（批号M22A10S95762，质量分数99.9%）、苍术素（批号P29N9F76159，质量分数98%）、β-桉叶醇（批号P24O8F46474，质量分数99.4%）均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，醋酸乙酯为分析纯，水为超纯水。
1.3动物
实验动物为SPF级雄性Wistar大鼠，共24只，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号SCXK（辽）2020-0001，质量合格证号210726210100 208713，动物实验经长春中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准文号2020317。
2方法与结果
2.1炮制前后挥发油及醇提物得率变化
取生北苍术、米泔水制北苍术粉碎过二号筛，各称定粉末约40 g，置于500 mL圆底烧瓶中，按固液比1∶8加入蒸馏水，浸泡1 h后，按《中国药典》2020年版四部2204通则附录（甲法）进行水蒸气蒸馏5 h，提取至无挥发油滴出，静止冷却1 h，氯化钠脱水后称定质量并计算挥发油得率。
取生北苍术、米泔水制北苍术粉碎过三号筛，各称取75.6 g，分别用10倍量体积80%乙醇浸泡12 h后超声提取，共提取3次，每次2 h，滤过，分别合并滤液，经40 ℃减压蒸干，称定质量并计算醇提物得率。
水蒸气蒸馏法提取的生北苍术挥发油呈棕黄色，黏稠，透明，且具有一定香味，得率为1.25%；米泔水制北苍术挥发油呈深棕黄色，黏稠，不透明，且具有一定香味，得率为0.80%；经米泔水炮制后挥发油得率比生北苍术挥发油得率降低了36%。醇提法提取的生北苍术醇提物得率为34.8%，米泔水制北苍术醇提物得率为29.3%，经米泔水炮制后醇提物得率比生北苍术醇提物得率降低了15.80%。
2.2 基于GC-MS分析炮制前后挥发油及醇提物成分变化
采用GC-MS联用方法得到挥发油及醇提物总离子流图，对2种提取方法下的炮制前后北苍术成分进行比较分析，同时对炮制前后化学成分进行鉴定，所得数据结果通过NIST11谱库匹配检索，在结合相关文献进行人工质谱图解析确定化合物，应用峰面积归一化法确定其相对含量。
2.2.1 GC-MS分析样品的制备 利用“2.1”项下方法制备挥发油，取100 μL挥发油，加入900 μL醋酸乙酯溶解，用0.22 μm滤头滤过后即得挥发油样品。利用“2.1”项下方法制备醇提物，加醋酸乙酯溶解定容至10 mL，用0.22 μm滤头滤过后即得醇提物样品。
2.2.2 挥发油样品气相色谱条件 色谱柱为Rtx-5毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；载气为高纯He（99.999%）；体积流量为1 mL/min；进样口温度250 ℃；自动分流进样；初始柱温为30 ℃，维持1 min，以15 ℃/min升温至150 ℃，再以2 ℃/min升至200 ℃，维持2 min，最后以20 ℃/min升至280 ℃，维持10 min。
质谱使用EI离子源轰击，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，扫描质量范围m/z20～500。溶剂切除时间5 min，开始时间5.0 min，结束时间50.0 min。
2.2.3 挥发油成分变化 挥发油总离子流图如图1所示。北苍术米泔水炮制前后挥发油中共发现有50种化学成分，多为醇类、芳香烃类、烯烃类、酯类和酮类等，结果见表1。可知生北苍术挥发油中相对含量较高的成分为2.3-二氢-1H-苯丙氨酸-1-酮（24.49%）、β-桉叶醇（21.61%）和茅术醇（7.37%）；米泔水制北苍术挥发油中相对含量较高的成分为β-桉叶醇（13.95%）、大根香叶烯（8.93%）和modephene （7.57%）。与生北苍术比较，炮制前后所含挥发油的化学成分种类无变化，但其相对含量有所改变。其中米泔水炮制后成分相对含量下降幅度较大的有2.3-二氢-1H-苯丙氨酸-1-酮（17.52%）、β-桉叶醇（7.66%）、β-桉叶烯（3.37%）、茅术醇（2.29%）和苍术酮（2.26%）；米泔水炮制后成分相对含量上升幅度较大的有modephene（4.77%）、大根香叶烯（4.35%）、双环[3,1,0]己-2-烯,2-甲基-5-(1-甲基乙基)（3.66%）、β-石竹烯（2.96%）和4-苯乙烯基哒嗪（2.49%）。
2.2.4 醇提物样品气相色谱条件 色谱柱为Rtx-5毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；载气为高纯He（99.999%）；体积流量为1 mL/min；进样口温度250 ℃；自动分流进样；初始柱温为60 ℃，以15℃/min升温至280 ℃，维持5 min。
质谱使用EI离子源轰击，电离能量70 eV，离子源温度250 ℃，接口温度250 ℃，扫描质量范围m/z30～500。溶剂切除时间4 min，开始时间4.0 min，结束时间20.0 min。
2.2.5 醇提物成分变化 醇提物总离子流图如图2所示。北苍术米泔水炮制前后醇提物中共发现有30种化学成分，多为酯类、醇类和酚类等，结果见表2。可知生北苍术醇提物中相对含量较高的成分为4-苯乙烯基哒嗪（17.18%）、β-桉叶醇（11.49%）和3-甲基-4-异丙基苯酚（10.86%）；米泔水制北苍术醇提物中相对含量较高的成分为5,8,11,14-花生四烯酸（19.73%）、2-硝基联苯（18.70%）和4-苯乙烯基哒嗪（11.94%）。
与生北苍术醇提物比较，炮制后醇提物中所含化学成分种类基本没有变化，但其相对含量有所改变。其中米泔水制后成分相对含量下降幅度较大的有3-甲基-4-异丙基苯酚（10.72%）、β-桉叶醇（10.66%）、4-(2,4,4-三甲基环己-1,5-二烯基)-3-丁烯- 2-酮（5.66%）和4-苯乙烯基哒嗪（5.24%）；米泔水制后成分相对含量上升幅度较大的有5,8,11,14-花生四烯酸（19.65%）、2-硝基联苯（16.16%）、N-[24-氧代-3α,7α,12α-三(三甲基硅氧基)-5β-胆聚糖-24-基]甘氨酸甲酯（8.13%）。
2.3基于HPLC测定挥发油及醇提物成分变化
利用“2.1”项下方法制备挥发油。取60 mg挥发油样品加10 mL甲醇溶解，即得挥发油HPLC样品；利用“2.1”项下方法制备醇提物，经40 ℃减压浓缩至100 mL，取适量浓缩液滤过即得醇提物HPLC样品；精密称取白术内酯II、β-桉叶醇、苍术素、苍术酮对照品适量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解制成质量浓度分别为10.1、33.0、44.0、53.4 μg/mL的混合对照品溶液，备用。色谱条件参考本课题组前期一测多评方法[11]，使用安捷伦Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱：0～3 min，55%乙腈；3～20 min，55%～60%乙腈；20～35 min，60%～65%乙腈；35～55 min，65%～85%乙腈；55～60 min，85%～95%乙腈，检测波长分别为208 nm（白术内酯II、β-桉叶醇，0～28 min）、340 nm（苍术素，28～45 min）、220 nm（苍术酮，45～60 min）；体积流量1 mL/min，柱温32 ℃；进样量15 μL。色谱图见图3。根据HPLC图谱，显示有4个含量较高的峰且分离度较好，即白术内酯II（峰1）、β-桉叶醇（峰2）、苍术素（峰3）、苍术酮（峰4）。由表3可知，经米泔水炮制后，4种成分均有不同程度降低，与生北苍术挥发油对比，米泔水制北苍术醇提物中白术内酯II、苍术素和苍术酮成分含量较高。
2.4对脾虚泄泻大鼠肠道真菌菌群的影响
2.4.1 样品采集 课题组前期已建立大鼠脾虚泄泻模型[9]，随机分为4组，每组6只，分别为空白组（KB）、模型组（MX）、生北苍术组（SC）、米泔水制北苍术组（MC），除空白组，其余各组均需造模，共10 d。造模结束后，生北苍术组和米泔水制北苍术组分别按生药量756 mg/mL制备醇提物，ig给予对应药液（10 mL/kg），1次/d，连续7 d。空白组ig给予等量生理盐水。试验共17 d。
大鼠粪便收集：试验第17天早8:00正常ig（提前12 h将各组大鼠置于代谢笼中），末次给药后12 h禁食不禁水，用无菌EP管收集大鼠新鲜粪便，迅速置于液氮中冷却，结束后将样品置于−80 ℃冰箱中保存。
2.4.2 数据处理与分析 Mass Hunter工作系统，NIST11谱库均由美国Agilent公司提供。采用Microsoft Office 2016进行数据处理，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析和Pearson相关性分析，单因素方差用最小显著差（least significance difference，LSD）检验，Pearson相关性分析用Pearson检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义；利用Origin 2021软件对成分-菌群作相关性图。
2.4.3 不同组别肠道真菌分类操作单元（operational taxonomic units，OTU）水平分析 每个组别随机选取3个粪便样品进行DNA的抽取，微生物多样性检验及引物设计由北京百迈客生物科技有限公司完成。由表4可知，经高通量测序从4组样品（空白组、模型组、生北苍术组、米泔水制北苍术组）的12份肠道粪便样品中共检测到真菌ITS的有效序列41 354个，平均长度为588.0 bp。在97.0%的相似度水平下进行OTUs聚类，获得1034个OTU。从不同处理组的真菌稀释曲线可知，OTU曲线斜率随测序次数增加均呈现先上升后平缓的趋势，从样品中获得的序列覆盖率高于90%，说明本研究测序数据量合理。结果见图4。
2.4.4 不同组别肠道真菌群落结构特征 经高通量测序，4个不同处理组12份样品中肠道真菌属于8门29纲69目135科243属386种。由图5-A可知，不同处理组中肠道真菌菌群有明显差异，主要包括10个优势菌群，分别为曲霉属Aspergillus sp.、镰刀菌属Fusarium sp.、枝孢属Cladosporium sp.、枝顶孢属Acremonium sp.、德巴利氏酵母属Debaryomyces sp.、被孢霉属Mortierella sp.、线黑粉酵母属Filobasidium sp.、链格孢属Alternaria sp.、节担菌属Wallemia sp.、毛壳菌属Chaetomium sp.。由图5-B可知，与空白组相比，模型组中菌群变化明显，Aspergillus sp.和Wallemia sp.真菌相对丰度显著降低（P＜0.05），Fusarium sp.真菌是空白组的12倍（P＜0.05）；生北苍术组中Acremonium sp.真菌最高（8.88%），是模型组的1.92倍，Mortierella sp.真菌显著降低38.18%（P＜0.05）；与模型组相比，米泔水制北苍术组未见Debaryomyces sp.真菌，其中Acremonium sp.和Alternaria sp.真菌分别较模型组显著降低20.20%、12.39%（P＜0.05），Aspergillus sp.和Wallemia sp.真菌相对丰度显著升高（P＜0.05）。
2.4.5 不同组别肠道真菌多样性分析
（1）α多样性分析：与空白组相比，模型组ACE指数升高了22.0%，Shannon指数和Simpson指数均显著升高（P＜0.01），分别是空白组的1.24倍和1.6倍，说明造模后物种丰富度增大，多样性变化明显。与模型组相比，生北苍术组ACE指数和Simpson指数最大，说明生北苍术组真菌群落多样性与丰富度较高，米泔水制北苍术组Shannon指数最大，2组与模型组相比均无显著性差异，见表5。
（2）β多样性分析：基于Abund_Jaccard距离算法，得到基于属水平的12份肠道真菌样品非加权配对平均法（UPGMA）聚类树状图。由图6可知，空白组中的优势菌种为曲霉属Aspergillus sp.，该真菌属在模型组中丰度明显降低（P＜0.05），生北苍术和米泔水制北苍术均能够回调其丰度，且米泔水制北苍术组作用优于生北苍术组。枝顶孢属Acremonium sp.真菌丰度在造模后丰度显著升高（P＜0.05），与模型组相比，生北苍术组丰度基本不变，经米泔水制北苍术治疗后，该属真菌丰度明显降低（P＜0.05），与空白组在属水平真菌群落结构相似，说明米泔水制北苍术对枝顶孢属真菌的抑制作用强于生北苍术。在属水平上整体分析，生北苍术组真菌群落结构与模型组相似，而米泔水制北苍术组更接近于空白组，说明米泔水制北苍术能够调节大黄所致的脾虚型腹泻，对于肠道真菌菌群的调控能力优于生北苍术。
2.4.6 4种化学成分与真菌群落的相关性分析 利用SPSS 21.0软件处理数据，建立肠道真菌群落中相对丰度前10的优势菌属与HPLC测量的4种成分含量的Pearson相关性分析，得出相关性系数 （P＜0.05），经筛选后构建出相关系数矩阵图，分析与脾虚泄泻模型有相关性的肠道真菌。如图7-A，属水平上，部分真菌与米泔水制北苍术中4种成分含量存在相关性，其中，Filobasidium sp.和Alternaria sp.真菌与白术内酯II含量显著正相关（P＜0.05），与苍术酮含量显著负相关（P＜0.05）。同时，Filobasidium sp.真菌与β-桉叶醇及苍术素含量也存在正相关。如图7-B，相对丰度前10的优势菌属与生北苍术中4种成分含量同样存在相关性，Debaryomyces sp.真菌与生北苍术中白术内酯II成分含量正相关，与苍术酮成分含量负相关。
3 讨论
中医认为腹泻由脾失健运、内伤饮食等多种因素引起，因此，常用化湿健脾类中药治疗腹泻[12]。中药因其不良反应小、价格低廉等优点，在腹泻治疗中彰显出不可替代的优势[13-15]。苍术是治疗脾虚久泻常用中药，前期已发现高剂量米泔水制北苍术醇提物可有效缓解脾虚泄泻模型大鼠便溏等症状，但作用机制尚不明确[9]。现代研究表明中药活性成分、中药复方可与肠道微生物相互作用以达到治疗效果，如黄连中生物碱类活性成分能抑制大肠埃希菌和霍乱弧菌增殖[16]；参苓白术散[17]能通过抑制肠道内致病菌增殖，促进有益菌生长，调节胃肠运动的方式来治疗腹泻。目前，肠道微生态相关研究多集中于肠道细菌，对真菌研究较少，而肠道真菌对维持肠道微生态平衡也具有重要作用。因此，研究肠道真菌与中药活性成分和疾病间的关系对人类健康有重要意义。
根据中药炮制理论，米泔水炮制可去除生品部分油脂，以降低药材辛燥之性，增强其补脾和中作用[18]。GC-MS结果显示，米泔水炮制后挥发油和醇提物化学成分类型未改变，仅改变相应百分含量，炮制后茅术醇、β-桉叶醇、α-红药没醇、苍术酮及多数酮类成分含量减少，大根香叶烯及多数酯类成分含量增加，其中，挥发油中苍术酮含量降低至炮制前47.1%，说明苍术酮是北苍术燥性成分之一，这与同属药材白术“减酮减燥，增酯增效”的观点一致[19]。此外，北苍术根茎中主要成分包括聚乙炔类苍术素和倍半萜类白术内酯II、β-桉叶醇、苍术酮等。但GC-MS法测定中未见《中国药典》2020年版规定的含量测定指标苍术素及白术内酯II等成分，推测与北苍术的提取方法密切相关。
为验证这一猜想，采用HPLC测定相同提取方法制备的样品，结果苍术素等4种成分均被检出。其中，生品化学成分含量大于米泔水制品，醇提物成分含量大于挥发油成分含量，这说明炮制过程中，热不稳定成分易发生降解和化学转化，导致很多沸点较低成分（燥性成分）流失，而水蒸气蒸馏法温度较超声提取法温度更高，因此醇提物成分含量高于挥发油成分含量。同时，虽然炮制后挥发油含量显著下降，但HPLC可测定活性成分苍术素的含量，进一步证明“以制其燥去其油”的观点正确，既达到降燥目的，又保证活性成分含量无过度流失，进而为发挥临床疗效提供保障。
相对于肠道细菌，真菌数量非常少，目前唯一被证实有益生作用且有临床应用的真菌是布拉酵母菌Sac-charomyce boulardii[20]。ITS高通量测序结果显示，不同组别肠道真菌菌群差异显著，10个优势菌群中曲霉属、镰刀菌属为常见肠道真菌[21-23]，曲霉属真菌在空白组及米泔水制北苍术组丰度最高，造模后镰刀菌属真菌丰度显著增加，生北苍术和米泔水制北苍术均能抑制镰刀菌属真菌活性。北苍术挥发油体外拮抗实验证实苍术酮和苍术素可抑制内生镰刀菌Fusariium sp.生长，并且对尖孢镰刀菌F. oxysporum、腐皮镰刀菌F. solani等病原菌抑制作用更强[24]，说明苍术酮和苍术素可能在拮抗病原真菌方面有重要作用。
α和β多样性结果表明，造模后真菌物种丰富度增大，多样性变化明显，这与在炎症性肠病患者结肠黏膜中可检测到真菌菌群多样性显著升高的情况类似[25-26]，而米泔水制北苍术组真菌群落结构更接近于空白组，说明米泔水制北苍术对菌群调节作用优于生北苍术。
通过肠道真菌与活性成分相关性分析，发现线黑粉酵母属和链格孢属真菌与白术内酯II和苍术酮含量的积累显著相关，且白术内酯II与苍术酮含量极显著负相关，进一步证明白术内酯II与苍术酮可相互转化。β-桉叶醇被证实对胃肠运动机能有双向调节作用[27]，线黑粉酵母属与β-桉叶醇也存在正相关，进一步说明米泔水制北苍术减燥健脾利湿作用与白术内酯II、苍术酮、β-桉叶醇等成分相关。
综上，本实验对北苍术米泔水炮制前后化学成分变化进行探究，并利用脾虚泄泻模型大鼠的粪便样品作肠道真菌相关性分析，研究发现北苍术米泔水炮制后减燥与白术内酯II、苍术酮等成分相关，健脾利湿作用的增强与β-桉叶醇和大根香叶烯等成分相关，线黑粉酵母属和链格孢属真菌可能与活性成分有相互作用，但仍需进一步验证。近年随着肠道微生物与各种疾病间相互关系研究的不断深入，肠道有益真菌将可能成为下一个研究热点，本研究将为肠道样本菌群中潜在有益真菌的研究及临床应用开发提供参考依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：方 晶，翁丽丽，王美怡，肖春萍，杨雪晴，孙 金，冯禹壮．北苍术米泔水炮制前后化学成分变化及其对脾虚泄泻大鼠肠道真菌菌群的影响 [J]. 中草药, 2022, 53(23):7372-7383.
转自：“如沐风科研”微信公众号
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