WB 条带大小和蛋白预测八字不合？先检查这 5 点

实验室玄学千千万，预测和结果不符占一半。

WB 实验是各位时常光顾的一个实验。但就是这样一个初级又常用的实验，却会出现各种稀奇古怪的问题。

比如在 WB 实验鉴定蛋白时，我们得到的蛋白质条带大小常常会和预测值有所偏差。这是身患「强迫症」的人不能忍的。如果是实验出错或者预测不准这种情况，是没办法跳出手机屏幕救你了。

但这下面的 5 条准则，倒是可以珍藏一下，在遇到蛋白质条带大小和预测值偏差的时候，拿出来分析一下。

我们可以对照着这张图来看原因：

下面就来详细地讲解一下这 5 条具体是个啥。

当我们做 WB 实验鉴定蛋白的时候，最喜欢看到的是这样的条带：

但通常，自己做出来的，就会变成这样：

是生活对我们这些实验小可爱下手了？

还是水逆没过去？

为什么 WB 跑了这么多次，

都和预测差了这么多？

当然不是那些玄学流原因啦。让我们科学地分析一下到底是哪里出了问题。

内源性蛋白 or 重组蛋白

如果是内源性蛋白还不打紧，如果是重组蛋白，那么马上就要看一看重组蛋白是否为全长序列了。假如样品是重组蛋白，还不是全长序列，那么条带大小一定会和预测大小不一致。

多个 isoform 辨仔细

如果确定了样品是内源蛋白，那就要看看我们的目标蛋白是不是有其他的 isoform，这个我们通常会去查看 NCBI 或者 SWISSPROT 来确认。

▲ SWISSPROT 会标出有些基因有多种 isoform

做着实验，结果换了别的 isoform 可就一顿瞎忙活啦。

剪切活化要注意

如果在 SWISSPROT 或者权威的文献里提到了，样品的这个蛋白需要剪切活化，那么结果又要和预测值不同啦。

成倍增长多聚体

如果蛋白大小和预测值有明显倍数关系，那就要考虑一下这个蛋白是不是二聚体或者多聚体啦。

蛋白修饰要变大

如果排除了以上原因，预测值和实验结果不一致，那就是因为我们面对的蛋白质，是个善变的对象，它不仅会剪切活化，还有在翻译表达后修饰。

比如：比如甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、烷基化、生物素化、谷氨酸化、甘氨酸化、硫酸化、异.戊二烯化、硫辛酸化、磷酸泛酰巯基乙.胺基化……balabala。

在不同状态下的蛋白质还会有不同的修饰。加入了官能团肯定会让蛋白质比预测值偏大。在日常的实验中，糖基化是比较常见的修饰，一般会导致跑出来的条带比预测值大那么一些。

转自：“丁香学术”微信公众号

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