Western Blot 实验可以说是生物专业最基础的实验了，然而 WB 实验天天做，但是正常高清的结果图却不是你想有就能有。
WB 实验出现最多问题的，应该就是各种背景问题了。
你想一下，好不容易实验过五关斩六将做到最后一步，扫描结果出了，是这样的：
为什么明明跑出了想要的趋势，但就是背景脏？怎么让自己的条带不因脏脏的背景而毁了呢？
这里要清楚一点，背景脏不一定是因为仪器不干净造成的，也有可能是蛋白降解或者整个实验过程中条件不合适造成的，有可能是以下的环节出了问题：
1、实验准备
提取蛋白所需的研磨器材，以及制胶的玻璃板、梳子要清洗干净;
若长期不使用，建议器材在实验前再行清洗一次以杜绝相应的污染。
2、提取蛋白
选择合适的蛋白裂解液，充分去除一些干扰因素，比如核酸，多糖，脂类等;
建议蛋白在测量浓度后变性分装保存，避免反复冻融使蛋白发生降解;
注意 Loading buffer 在保质期内，蛋白加入 Loading buffer 后充分混匀，再煮沸变性。
3、制胶
玻璃板夹紧之后，有些人习惯性加水试一下是否漏胶，建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水；
灌胶之前要将配好的试剂充分混匀，灌胶的过程中要掌握好速度，缓慢加入，避免产生气泡；
灌注好分离胶后，缓缓加入无水乙醇封胶，该步操作时速度一定要慢，防止胶面被冲变形；在等待分离胶凝固的过程中，不要总去摇晃观察；
温度较高的情况下，30 min 左右就会凝固，冬天气温较低可能需要较长时间；
若分离胶液面不平，会影响后期蛋白电泳的效果。
4、转膜
转膜前需在转膜板两侧各放置 3 至 4 张滤纸(两侧数量相同)；
切记不要用手直接接触 PVDF 膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，务必佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取；
转膜过程中海绵-滤纸-凝胶-PVDF 膜-滤纸-海绵每一层的气泡要排空；
转膜时要使整个电转仪置于冰水混合物中，常用 220 V 或者其他高电压进行；
机器温度升高，会使蛋白降解，也就是转膜后，用丽春红染色发现条带跑糊，发光后条带和背景也会脏的一塌糊涂。
5、孵育抗体
孵育一抗的时间大多会选择 4 ℃过夜，也可以室温封闭 2 小时，4 ℃ 过夜效果会比室温好，4 ℃ 过夜具体多长时间算合适，其实没有硬性规定；
二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育 1 到 2 小时，抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。
6、发光液配置
大部分实验室使用的 ECL 发光液，A 液和 B 液按照 1：1 的比例配置；
发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量；
发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。
转自：“生物学霸”微信公众号
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