可逆和动态RNA修饰在基因表达调控中具有多种功能。N6 -甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是哺乳动物细胞中最丰富的RNA修饰，也是研究得最好的转录组标记。尽管开发了各种工具来绘制m6A图谱，但缺乏一种能够在单碱基分辨率下对m6A进行绝对量化的转录组范围的方法。
2022年10月27日，北京大学王晶团队与伊成器团队合作在Nature Biotechnology杂志在线发表题为“Absolute quantification of single-base m6A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI” 的研究论文，该研究使用乙二醛和亚硝酸盐介导的未甲基化腺苷脱胺(glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosines, GLORI)来开发一种绝对m6A定量方法，并应用GLORI对小鼠和人类细胞的m6A甲基化组进行了定量，揭示了具有差异分布和化学计量的聚类m6A修饰。
总之，这项研究开发的GLORI是一种对m6A甲基化修饰进行绝对定量的无偏、方便的方法。
N6 -甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是高等真核生物中最丰富的内部修饰，所有腺苷中占0.2-0.6%。它被一个由METTL3, METTL14, WTAP, KIAA1429和RBM15组成的甲基转移酶复合物添加到RNA上，并可被FTO和ALKBH5去除。m6A修饰的存在会影响各种RNA特性，如稳定性、翻译效率、选择性剪接和易位，并对各种生理和病理条件产生影响。
目前m6A已通过各种转录组范围的方法进行了分析。第一种方法(如m6A-seq和MeRIP-seq)依赖于m6A抗体来识别含有m6A的RNA片段。随后开发许多其他基于抗体的方法，包括PA-Seq, miCLIP, m6A -LAIC-seq和m6A -seq。然而，基于抗体的方法存在分辨率有限和缺乏特定修饰位点的定量信息的问题。此外，m6A抗体与某些RNA序列或结构的混杂结合也会降低m6A检测的特异性。
随后，一些不依赖于抗体的m6A检测方法被开发。例如MAZTER -seq和m6A- REF -seq在MazF核酸内切酶的基础上检测m6A位点，但它们缺乏灵敏度，因为该酶只检测ACA基序中的m6A位点。不仅如此，核糖核酸内切酶不能在未修饰的ACA位点实现100%的切割，从而影响了m6A检测的准确性。DART-seq, m6A- SEAL-seq和m6A-label-seq为获取m6A修饰信息提供了新的选择，但它们仍然缺乏化学计量信息。最近开发的基于酶的方法m6A-SAC -seq显示出对GAC背景下的m6A偏好，并依赖于基于峰值RNA的标准化定量。位点特异性定量方法已有报道，但它们不能实现对m6A的转录组范围的测量。
为了解决现有方法的局限性，研究人员开发了一种基于测序的、高通量的、单碱基分辨率的方法——GLORI。通过使用乙二醛和亚硝酸盐的催化体系，对未甲基化的腺苷进行高效地脱氨从而形成肌苷(A-to-I, > 98%)，肌苷在逆转录过程中和胞苷配对，在测序过程中被读成鸟苷(G)，从而形成A-to-G的转化，而m6A则保持不变，测序后仍被读成A。GLORI通过对测序的读段序列中A所占的比例，实现了对单碱基m6A的绝对定量（图1）。这种方法与DNA 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)的亚硫酸氢盐测序类似。
图1. GLORI 的检测原理
在HEK293T转录组中，研究人员鉴定出176,642个m6A位点，中位甲基化水平约为40%，约38%的位点的修饰率高于50%。值得注意的是，约33%的m6A发生在修饰簇中，其特征是较高的甲基化水平，在基因表达调控中很重要。此外，研究人员发现随着测序深度的增加，可检测的m6A位点进一步的增加，这一现象扩展了人们对mRNA上m6A存在数量的认识（图2）。
图2. GLORI转录组内定量检测m6A
有趣的是，GLORI技术还能够实现对m6A的准确定量，即使修饰水平较低的m6A（5%），GLORI也能够实现准确检测。令人满意的是，GLORI检测m6A位点的修饰水平具有很高的技术重复性，提示GLORI定量检测具有良好的稳定性。
进一步分析表明，约91%的GLORI检测位点符合m6A的经典序列DRAC (D=G/A/T, R=A/G)，且分布规律与以往研究一致，即在终止密码子附近、CDS和3’UTR富集。此外，GLORI分析显示热休克和缺氧处理动态诱导m6A，提供了m6A甲基组对应激响应的定量视图。
总的来说，这项研究表明GLORI是一种无偏倚的工具，用于单碱基分辨率的转录组范围的m6A检测。该方法操作方便，具有较强定量能力，有望成为m6A定量分析的金标准。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01487-9
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