1、文献题目
Atomically Site Synergistic Effects of Dual-Atom Nanozyme Enhances Peroxidase-like Properties
文献期刊：Nano Lett.
10.1021/acs.nanolett.3c01454
2、文献作者
宋继彬，北京化工大学，化工资源有效利用国家重点实验室教授、博士生导师、国家级高层次青年人才。主要研究领域或方向：1、新型多功能材料的设计与合成方法学研究。2、有机-无机杂化材料的开发新技术及应用研究。3、生物传感与疾病诊断新技术及新产品的研究及应用。4、面向活体的分子影像新技术与定量检测新方法。5、生物安全及可降解医疗器件的开发及临床应用。
唐点平，福州大学化学学院教授，博士生导师，“闽江学者”特聘教授，德国“洪堡学者”。主要研究领域或方向：(1) 在免疫传感探针构建方面：研制新型纳米材料，构建免疫传感界面，制备新型免疫传感探针，用于临床上肿瘤标志物及食品中生物毒素快速、灵敏的检测；(2) 在信标抗体标记技术研究方面：结合纳米标记和生物学技术放大策略，制备新型纳米标记探针，构型多重信号放大免疫分析策略；(3) 在免疫传感模式改进方面：结合物理学和化学生物学知识，构建新型免疫传感分析体系，实现对传统免疫分析模式的革新。
3、文献提出的科学问题
单原子纳米酶(SAzymes) 通常只有一种类型的单原子活性位点，这使得难以优化涉及多个中间体的反应的催化活性。双原子催化剂在优化金属活性位点和吸附不同类型的反应中间体方面具有较高的催化性能和选择性。
4、分解为几个研究目标
1、通过简单的水热策略，采用甲酰胺缩合/碳化法，以甲酰胺为碳氮源，在缩合/炭化过程中引入过渡金属盐，实现大量原子级分散的N配位的金属位点。
2、DFT计算双原子位点的存在对底物或中间体的吸附以及反应势垒。
3、细胞以及活体实验进一步证实其体内和体外抗肿瘤效果以及毒性。
5、研究总体方案
通过甲酰胺缩合/碳化法，以甲酰胺为碳氮源，在缩合/炭化过程中引入过渡金属盐，实现大量原子级分散的N配位的金属位点。
6、方法和技术手段
SEM、TEM、XPS、Zeta potential、XRD、Raman、UV-vis、同步辐射、DFT
7、主要研究成果
1、TEM结果显示合成的纳米材料没有颗粒存在，HRTEM结果进一步证实了无纳米颗粒或者团簇的存在，与NC结果相似。XPS结果显示FeCo-NC中Fe和Co的存在，表明NC牢固地锚定了过渡金属原子。Fe 2p和Co 2p XPS光谱证实了FeCo-NC中存在Fe和Co氧化态。FeCo-NC和NC在27°附近观察到尖锐的XRD衍射峰，与氮化碳相的(002)峰相匹配。FeCo-NC和NC的拉曼光谱分别在1350 cm−1和1508 cm−1处显示两个低强度峰，这两个峰属于甲酰胺衍生的碳质材料的D和G波段。经像差校正的HAADF-STEM图像显示，许多亮点随机分布在整个样品中，对应于嵌入在甲酰胺衍生NC中的单原子Fe和Co位点。XANES结果可以看到Fe k边光谱显示FeCo-NC的吸收边位置位于FeO和Fe3O4之间，表明Fe的正价态在+2和+3之间。同样，FeCo-NC的Co K-edge XANES曲线与Co3O4曲线非常接近，说明Co原子的正价态也在+2 ~ +3之间。FeCo-NC的扩展x射线吸收精细结构(EXAFS)在1.50 Å和1.38 Å处显示出两个突出的峰，分别证实了Fe−N和Co−N配位构型的存在。EXAFS拟合结果表明，Fe原子由4.38个N原子(Fe-N键长:2.03 Å)与1.0个O原子(Fe- O键长:1.77 Å)配位，Co原子由4.0个N原子(Co -N键长:2.01 Å)与1.0个O原子(Co - O键长:1.79 Å)配位。FeCo-NC的小波变换等值线图显示，其最大强度约在4 Å−1处，属于Fe−N和Co−N配位，与Fe箔和Co箔不同。
2、我们使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)作为显色物质，系统地比较并揭示了不同的M1-N4或M1-N4/M2-N4活性位点对POD-样活性的影响。FeCo-NC在弱酸性环境(pH = 4)中表现出最佳的催化性能，这归因于H2O2在碱性条件下更容易分解成O2和H2O。在20分钟内对所有样品进行反应动力学曲线研究，以评估催化活性。在所有SAzymes中，Fe-NC表现出最优异的POD-样催化性能，证明Fe-N4活性中心在催化活性中占主导地位。相比之下，其余非Fe系列的DAzymes没有显著提高催化活性，上述结果表明，在Fe位附近掺杂异核原子可以在一定程度上提高类POD酶催化性能。在Fe-NC和FeCo-NC中观察到显著强度比为1:2:2:1的DMPO/·OH加合物的特征性四重信号，证实了通过芬顿反应形成了·OH。此外，FeCo-NC体系中的峰强度远高于Fe1-NC，表明FeCo-NC更易于产生·OH，并与类POD酶活性一致。过氧化氢在FeCo-NC和Fe-NC上的米氏常数(Km)分别为0.40和1.50 mM，表明FeCo-NC对过氧化氢的亲和力高于Fe-NC。根据不同温度下TMB氧化的实测动力学和相应的Arrhenius方程，获得了FeCo-NC和Fe-NC的活化能(Ea)。FeCo-NC的Ea为9.46 kJ/mol，比Fe-NC的Ea(41.05 kJ/mol)低4.3倍，表明具有双原子位点的FeCo-NC可以有效地降低催化反应的能垒。
3、密度泛函理论(DFT)计算进一步揭示了铁系DAzymes增强的类POD-催化机理。正如先前的工作所报道的，H2O2和金属之间的吸收能可以用作研究类POD-活性的描述符。铁系DAzymes的电子结构计算表明，异核原子的引入可以提高铁位的d带中心和电子，从而提高H2O2的吸附。此外，计算了酸性条件下H2O2在Fe-NC和FeCo-NC上分解氧化TMB的可能途径和相应的自由能分布。H2O2很容易吸附在Fe-NC和FeCo-NC的单原子Fe位的顶部，形成活化的H2O2* (*代表吸附状态)。活化的H2O2分子在金属位点上均匀解离成两个*OH离子。H2O2在Fe1Co1-NC上的离解能为1.98 eV，低于Fe1NC的离解能(1.44 eV)，这可能是由于其中一个*OH迁移到Co位使离解更容易。最后，吸附的OH*在弱酸性环境中与质子化的H+和TMB反应，形成H2O和oxTMB。此外，我们还研究了2OH*单点和双点吸附电荷的分布。从差分电荷可以看出，2OH*在FeCo-NC上得到的电子数(−0.83)比Fe-NC(−0.90)要少，这将进一步刺激OH*从TMB中提取电子的行为。通过DFT结果发现的FeCo-NC在双原子位点具有较高的POD酶活性的原因可以归结为以下两个方面。首先，异核金属位点的掺杂可以调节材料的电子结构和d带中心，从而优化底物的吸附。此外，第二个原子位点可以作为活性位点以及吸附位点，稳定中间体并使反应更容易。光热测量结果表明，单原子铁和钴的逐步掺杂可降低 NC 的能带，进一步提高光热效率（FeCo-NC：50.20%）和光增强 POD 酶活性。
4、考虑到FeCo-NC优异的光热性能和POD 酶性能，可以考虑将其作为肿瘤治疗的治疗剂。最初，FeCo-NC + H2O2 + NIR (200 μg/mL)组B16-F10细胞活力最低(7.09%)，显示出良好的治疗效果。随后，通过DCFH-DA测定细胞内ROS的生成，探讨细胞死亡的可能机制。在对照、NC、FeCo-NC和NC + H2O2组中，相应的绿色荧光可以忽略不计。相反，在FeCo-NC + H2O2基团中可以观察到适量的绿色荧光，说明FeCo-NC具有一定的催化细胞内H2O2生成•OH的能力，表现出令人满意的POD 酶行为。正如预期的那样，FeCo-NC + H2O2 + NIR组在所有组中表现出最强的绿色荧光。细胞内ROS实验表明，FeCo-NC的POD 酶性能可以通过光热效应进一步协同放大，从而增加细胞内•OH浓度。六组细胞处理后用Calcein-AM(绿色荧光表示活细胞)和PI(红色荧光表示死细胞)染色，用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像。与FeCo-NC+H2O2(2.78±0.80)、NC+H2O2(0.48±0.16)、FeCo-NC(1.75±0.33)、NC(0.47±0.25)和对照组相比，用FeCo-NC + H2O2 + NIR组处理的B16-F10细胞显示最强的红色荧光(57.55±5.00)和最弱的绿色信号。此外，采用FITC/PI (Annexin v -异硫氰酸荧光素/碘化丙啶)染色后的典型流式细胞术检测不同治疗组肿瘤细胞的凋亡/坏死情况。FeCo-NC + H2O2 + NIR组诱导的细胞凋亡率(Q2 + Q3, 78.90%)显著高于FeCo-NC + NIR组(11.68%)、FeCo-NC + H2O2组(6.03%)、NC + H2O2组(2.38%)、FeCo-NC组(4.51%)、NC组(0.80%)和对照组(0.57%)。体外实验结果表明，Fe1Co1-NCs不仅可以进行pod样纳米催化治疗诱导肿瘤细胞凋亡，还可以通过近红外光热效应进一步放大，实现对癌细胞的有效协同消融。线粒体膜电位(MMP)的降低与细胞内ROS水平升高导致细胞凋亡有关，JC-1实验进一步证实了这一点(红色荧光:健康线粒体;绿色荧光:相反)。如预期的那样，对照组的红绿荧光比为533.23，而NC、FeCo-NC、NC + H2O2、FeCo-NC + H2O2和FeCo-NC + H2O2组的红绿荧光比分别降至23.07、9.06、2.15、1.48和0.08。
5、FeCo-NC对体外细胞的优异协同治疗作用促使我们利用荷瘤小鼠进一步探索其对体内肿瘤生长的抑制作用。溶血实验结果表明，FeCo-NC在5、25、50和100 μg/mL浓度范围内溶血率较低，具有良好的体内生物安全性。我们通过静脉注射Fe1Co1-NC来治疗荷瘤小鼠。荷瘤小鼠的红外热成像(IR)显示，注射NC和FeCo-NC后5分钟内，肿瘤部位的表面温度分别升高到51.4和68.8℃，远高于PBS(38.5℃)。在治疗后第0天和第10天拍摄不同组的代表性小鼠肿瘤的照片,并进一步解剖。结果表明，FeCo-NC + NIR组的治疗效果极佳，表明纳米催化疗法与光热疗法的巧妙结合能够抑制肿瘤生长，显著提高治疗效率。此外，每2天测量5组的肿瘤大小生长，并计算治疗期间的相对肿瘤体积变化。除了对照组，其余4个治疗组在10天的治疗中显示出不同程度的肿瘤抑制。值得注意的是，在FeCo-NC + NIR组中记录了最强的肿瘤生长抑制，显示了光热增强纳米催化疗法的抗肿瘤效果。在治疗期间，不同治疗组中的荷瘤小鼠的体重没有明显下降，表明FeCo-NC或NC对小鼠的毒性可以忽略不计。同时，在处死小鼠以收集眼球血液后，进行常规血液测试和生化分析。大多数小鼠某些指标的浓度在正常范围内波动。此外，通过苏木精-伊红(H&E)和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色检查了各种治疗后荷瘤小鼠的肿瘤组织破坏。如H&E染色分析和TUNEL免疫荧光染色所揭示的，与其他组相比，FeCo-NC + NIR组导致癌细胞的显著凋亡，进一步证实了FeCo-NC纳米酶优越的体内抗肿瘤能力。最后，根据H&E染色的病理学分析,在各种处理后，各组中主要器官的炎症或变形可以忽略不计，这表明FeCo-NC在体内处理中具有良好的生物相容性。
8、作者给出结论
1、报道了含有19种不同M1NC或M1M2-NC的SAzymes和DAzymes文库的合成，以揭示POD酶催化活性。实验结果表明，双原子位点Fe1Co1-NC表现出最优异的类POD酶活性和优异的光热转换效率。
2、DFT结果表明，双原子位点的存在不仅可以通过协同优化底物或中间体的吸附来破坏SRL，还可以作为活性中心来降低反应势垒。
3、在FeCo-NC中同时实现了极低的副作用和异常高的体内和体外抗肿瘤效果，突出了其广泛临床治疗应用的潜力。
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