血栓性浅静脉炎（superficial thrombophlebitis，STP）是临床常见的一种血栓性、炎症病变的血管性疾病，主要表现为病变浅静脉出现条索状硬块，形如蚯蚓，色赤，可出现局部红肿疼痛[1]。由于其早期临床症状相对较轻，患者未进行及时有效的治疗，出现血栓脱落，可诱发深静脉血栓、心、肺、脑血管栓塞等并发症，对生命健康造成严重威胁。临床上常用的治疗药物多为抗感染、抗凝、溶栓类药物、非甾体抗炎药、免疫抑制剂等，虽然能在一定程度上缓解患者的临床症状，但其治愈率低，治疗效果欠佳，治疗成本较高且常导致多种不良反应[2]。中医认为STP属于“赤脉、青蛇毒、恶脉、脉痹”等范畴，湿热浊瘀阻络是基本病机，应采用清热利湿、化瘀通络、祛湿消肿的方式治疗。
脉络舒通丸源于国医大师唐祖宣先生的经验方，全方由黄芪、金银花、黄柏、苍术、薏苡仁、玄参、当归、白芍、水蛭、蜈蚣、全蝎和甘草共12味中药组成，方中黄芪、金银花为君药；黄柏、苍术、薏苡仁、当归、白芍、玄参为臣药；水蛭、全蝎、蜈蚣为佐药；甘草为使药，调和诸药；共奏清热解毒、化瘀通络、祛湿消肿的功效，与STP湿热浊瘀阻络的病机相契合。现代药理学研究显示，黄芪和当归及其活性成分均具有抗氧化、抑制炎症介质表达、抗血小板凝集和抗血栓形成的作用[3-4]；金银花和玄参的提取物可显著降低白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的产生，达到良好的抗炎作用[5-6]；水蛭、蜈蚣和全蝎均可抑制血小板聚集，增强纤溶活性，具有明显的抗血栓形成的功效[7]，表明脉络舒通丸可起到防止血栓形成和抑制炎症作用。目前，脉络舒通丸广泛应用于临床治疗STP[8]，疗效显著，不良反应少，但关于脉络舒通丸的研究主要集中在临床疗效方面，缺乏其具体作用机制方面的研究。
网络药理学是在系统生物学的基础上结合现代的计算机技术构建“药物-靶点-疾病”相互作用网络，揭示药物与治疗疾病之间的分子关联规律，从多维度探讨中医药与疾病的关系，体现中医药治疗疾病的整体性[9-11]。因此，本研究首先基于网络药理学探讨脉络舒通丸抗STP的潜在作用机制，筛选出关键信号通路，然后通过体内动物实验，采用20%甘露醇建立STP兔模型，运用Western blotting技术进一步探究脉络舒通丸抗STP的作用机制，为其临床治疗STP奠定坚实的理论基础和科学依据。
1 材料
1.1 动物
36只健康日本大耳白兔，雌雄各半，2.50～2.75 kg，购自中国食品药品检定研究院［许可证号SCXK（京）2019-0006］，饲养于天津中医药大学实验动物中心，适应性饲养7 d。饲养条件为12 h光照/12 h黑暗，单笼饲养，室温（25±2）℃，自由饮水和进食。本实验中所有操作均符合相关动物实验伦理原则，并获得天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号TCM-LAEC2021253）。
1.2 药品与试剂
脉络舒通丸（批号918200011）由鲁南厚普制药有限公司提供；20%甘露醇（批号201003A01）购自山东华鲁制药有限公司；0.9%氯化钠注射液（批号2112221909）购自石家庄四药有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒（批号分别为JYM0003Rb、JYM0011Rb、JYM0006Rb）购自武汉基因美科技有限公司；ECL化学发光试剂盒（批号S7105010）、BCA蛋白定量试剂盒（批号20201ES76）购自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA组织/细胞裂解液（批号R0010）购自北京索莱宝科技有限公司；Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）兔单克隆抗体（批号AB32101）、信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）鼠单克隆抗体（批号AB68153）购自英国Abcam公司；磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）鼠单克隆抗体（批号BS4605）购自美国Bioworld公司；p-PI3K鼠单克隆抗体（批号4228）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）鼠单克隆抗体（批号2920）、p-Akt鼠单克隆抗体（批号5106）、p-JAK2兔单克隆抗体（批号3771）、p-STAT3兔单克隆抗体（批号9145）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）鼠单克隆抗体（批号97166）购自美国CST公司；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（批号S0001）、HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗（批号S0002）购自美国Affinity Biosciences公司。
1.3 仪器
Infinite M200 Pro型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；3K15型冷冻高速离心机（美国Sigma公司）；ASP200S型自动真空组织脱水机、EG1150H型自动生物组织包埋机、RM2255型切片机（德国Leica公司）；DYY-7C型、DYCZ-40D型电泳转膜设备（北京六一生物科技有限公司）；Chemi Scope6200型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；Nikon Ci-L型显微镜（日本Nikon公司）。
2 方法
2.1 网络药理学预测脉络舒通丸抗STP的作用机制
2.1.1 脉络舒通丸活性成分及其作用靶点获取 运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索脉络舒通丸活性成分，并根据药物的吸收、分布、代谢、排泄（absorption, distribution, metabolism, excretion，ADME）参数，设定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18作为筛选条件，得到脉络舒通丸的潜在活性成分。由于TCMSP中未筛选到水蛭、蜈蚣、全蝎的活性成分，故通过CNKI数据库中相关文献补充水蛭、蜈蚣、全蝎的活性成分[12-17]，将补充成分整合到TCMSP数据库的筛选结果中。并应用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取活性成分的简化分子线性输入规范（simplified molecular input line entry system，SMILES）。
将脉络舒通丸活性成分的SMILES导入SwissTargetPrediction数据库（http://www. swisstargetprediction.ch/），限定物种为“Homo sapiens”，选择“possibility”大于0的靶点作为脉络舒通丸活性成分的成分作用靶点。
2.1.2 STP疾病作用靶点获取 以“superficial thrombophlebitis”和“superficial vein thrombosis”关键词进行检索，在GeneCards（https://www. genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）和GisGeNET（https://www.disgenet.org/）数据库中进行检索，并将3个数据库获得的靶点合并去重复项后，规范化后得到STP疾病作用靶点。
2.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建及分析 将脉络舒通丸的潜在活性成分作用靶点与STP疾病作用靶点导入VENN（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线工具，取其交集，获得共同靶点。通过STRING数据库（https://cn.string-db.org/）对共同靶点进行PPI网络构建。
将PPI网络导入Cytoscape 3.7.2平台进行可视化分析，并使用Network Analyzer插件进行网络节点的拓扑参数分析。以“度值＞中位数、介数中心性＞中位数、中心接近度＞中位数”作为筛选条件，获取脉络舒通丸抗STP的核心靶点。
2.1.4 基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 为进一步探索脉络舒通丸治疗STP的作用机制，将核心靶点导入DAVID 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/），使用“Functional Annotation”功能，将物种设置为“Homo sapiens”，进行GO功能和KEGG信号通路富集分析。根据P值从小到大，筛选出脉络舒通丸抗STP的主要生物过程及信号通路。
2.2 动物实验
2.2.1 分组、造模及给药 将36只兔随机分为对照组、模型组、地奥司明（0.168 g/kg，相当于临床等效剂量）组和脉络舒通丸低、中、高剂量（0.56、1.68、5.04 g/kg，分别相当于临床剂量的1/3、1、3倍）组，每组6只。除对照组外，其余各组采用双侧耳缘iv 20%甘露醇建立STP兔模型，采用兔固定器限制兔子活动，距耳尖2 cm处，用生理盐水进行耳缘静脉预穿刺，确保头皮针在静脉中同时药液无渗漏，以1 mL/min缓慢推注20%甘露醇溶液（4.0 mL/kg），药物注射结束后推注1 mL生理盐水，每日2次注射，共注射14 d。造模期间每日观察耳缘静脉及其周围组织皮肤颜色，若皮肤变红并有硬结，表示STP兔模型构建成功。造模同时，对照组和模型组ig纯水，各给药组ig相应药物，1次/d，连续14 d。实验结束后，ip戊巴比妥钠麻醉，静脉取血，离心获取血清；以静脉穿刺点前方1.5 cm为中心，切取1 cm2耳廓组织，用于后续实验。
2.2.2 兔耳组织苏木素-伊红（HE）染色 取兔耳组织经4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋后进行连续切片，进行常规HE染色步骤，在光学显微镜下观察耳组织耳缘静脉及周围组织的病理学变化。
2.2.3 血清炎症因子水平检测 取各组兔血清，按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α、IL-1β和IL-6水平。
2.2.4 Western blotting检测兔耳组织相关蛋白表达 取兔耳组织匀浆，RIPA裂解液进行充分裂解，离心提取兔耳总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液室温封闭1 h，分别加入PI3K（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p-Akt（1∶1000）、JAK2（1∶1000）、p-JAK2（1∶1000）、STAT3（1∶1000）、p-STAT3（1∶1000）和GAPDH（1∶3000）抗体，4 ℃孵育过夜；加入相应二抗（1∶3000），室温孵育1 h后洗膜，ECL显影，凝胶成像系统拍照并进行灰度值分析。
2.3 统计学分析
所有数据以表示，采用SPSS 23.0软件进行统计分析，多组间比较为正态分布时，采用单因素方差分析，方差齐使用LSD法进行组间比较，方差不齐则用DunnettT3检验；非正态分布用Kruskal-Wallis秩和检验。
3 结果
3.1 网络药理学分析
3.1.1 脉络舒通丸活性成分及其作用靶点获取 根据TCMSP数据库的检索结果及文献检索，收集整理并去除重复成分后得到脉络舒通丸145个活性成分，其中黄芪活性成分14个、金银花活性成分15个、黄柏活性成分29个、苍术活性成分2个、薏苡仁活性成分8个、玄参活性成分4个、当归活性成分2个、白芍活性成分6个、甘草活性成分61个、水蛭活性成分11个、蜈蚣活性成分12个、全蝎活性成分6个。将各活性成分的SMILES导入SwissTargetPrediction数据库进行脉络舒通丸活性成分的作用靶点预测，共获取10 591个成分作用靶点，去除9479个重复靶点，得到脉络舒通丸的1112个活性成分作用靶点。
3.1.2 STP疾病作用靶点获取 以“superficial thrombophlebitis”和“superficial vein thrombosis”关键词分别在GeneCards、OMIM和GisGeNET数据库中进行检索，分别得到272个、384个和5个STP疾病作用靶点，合并整理3个数据库检索结果共获得856个疾病作用靶点，删除19个重复项，获得837个STP疾病作用靶点。
3.1.3 脉络舒通丸活性成分与STP疾病的共同靶点PPI网络构建及分析 将脉络舒通丸的1112个活性成分作用靶点与837个STP疾病作用靶点导入Venn在线工具，取其交集，并绘制Venn图，得到共同靶点84个，见图1。将得到的84个共同靶点导入STRING数据库中，隐藏孤立靶点，构建得到具有80个点，825条边的共同靶点PPI网络，见图2，
其中节点代表共同靶点；节点大小和颜色深浅代表度值大小，节点越大、颜色越深，代表度值越大，靶点越关键；节点间连接的直线表示2个共同靶点之间有相互作用。
将脉络舒通丸活性成分与STP疾病的共同靶点PPI网络导入Cytoscape 3.7.2平台进行可视化分析，并使用NetworkAnalyzer插件进行网络节点的拓扑参数分析。以度值＞中位数（19.00）、介数中心性＞中位数（14.99）、中心接近度＞中位数（0.54）作为筛选条件，得到31个脉络舒通丸抗STP的核心靶点，其关键拓扑参数，见表1。
3.1.4 脉络舒通丸抗STP的关键靶点的GO功能和KEGG通路富集分析 使用DAVID 6.8数据库对31个脉络舒通丸抗STP的核心作用靶点进行GO功能富集分析（P＜0.05），共得到150个条目，包括113个生物过程（biological processes，BP）、22种细胞组分（cellular components，CC）、15种分子功能（molecular functions，MF），根据P值分别选取前10条进行可视化处理，见图3。BP主要涉及平滑肌细胞增殖的正调控、炎症反应的正调控、凋亡过程的调控等，CC主要涉及细胞外区域、细胞外间隙、细胞膜等，MF主要涉及PI3K结合、蛋白磷酸酶结合、内肽酶活性等，体现脉络舒通丸抗STP是多重作用的结果。
KEGG通路富集分析中共获得118条相关信号通路（P＜0.05），根据P值由小到大顺序制作排名前20的信号通路气泡图，见图4，其中包括JAK/STAT、PI3K/Akt 2条主要炎症相关信号通路，流体剪切应力和动脉粥样硬化、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）2条与血管性疾病相关信号通路，5条癌症相关信号通路，7条病毒相关信号通路，4条其他信号通路。由于STP的发生发展与炎症和血栓密切相关，因此，本研究对KEGG信号通路富集分析结果中2条炎症相关信号通路和2条与血管性疾病相关信号通路进行文献调研。
经文献检索，流体剪切应力和动脉粥样硬化、VEGF信号通路参与机体血管生成，促进血管内皮细胞增生与凋亡[18-19]；JAK/STAT信号通路可通过维持血管内皮细胞的稳态、抑制血管内的氧化应激及炎症损伤，PI3K/Akt信号通路具有抑制炎症和抗血栓形成的作用[20-21]。由此可知，流体剪切应力和动脉粥样硬化、VEGF信号通路以影响血栓为主；而PI3K/Ak和JAK/STAT信号通路主要与炎症反应和血栓形成密切相关，且这2条信号通路的相关研究较多，P值排名较小。故本研究预测脉络舒通丸可能是通过调控PI3K/Akt和JAK/STAT信号通路发挥抗STP作用。
3.2 脉络舒通丸抗STP的体内实验作用机制研究
3.2.1 脉络舒通丸对STP模型兔耳组织病理形态的影响 如图5所示，对照组兔耳组织中静脉内皮细胞形态完整，呈梭形均匀有序的排列，内膜光滑无脱落现象，且无任何血栓和炎性细胞的浸润。与对照组比较，模型组兔耳组织血管管腔被破坏，静脉内膜无规则性严重脱落，管腔内有明显血栓产生，管壁及周围组织可见大量炎性细胞的浸润，表示STP兔模型建立成功。与模型组比较，各给药组兔耳组织静脉内皮细胞形态完整性和内膜脱落情况均有不同程度的改善，仅可见轻微血栓形成，少量炎性细胞局部浸润于管腔和周围组织，以脉络舒通丸高剂量组病理改善最为明显。
3.2.2 脉络舒通丸对STP模型兔血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响 如图6所示，与对照组比较，模型组兔血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。提示脉络舒通丸对STP模型兔血清炎症水平具有显著的抑制作用。
3.2.3 脉络舒通丸对STP模型兔JAK/STAT、PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响 为了进一步研究脉络舒通丸抗STP的分子机制，本研究测定网络药理学预测PI3K/AKT、JAK/STAT信号通路中关键蛋白的表达水平。如图7所示，与对照组比较，模型组兔耳组织中Akt、PI3K、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平明显上调（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组Akt、PI3K、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平明显下调（P＜0.05、0.01）。表明脉络舒通丸可通过抑制PI3K/Akt、JAK2/STAT3信号通路发挥抗STP作用。
4 讨论
STP为临床常见的周围血管疾病，临床以躯干部或肢体处浅静脉发生血栓性、炎症病变，静脉循行处出现结节或条索状，伴有明显触痛等为主要表现特征。STP归属于中医学“脉痹”“赤脉”“青蛇毒”等范畴。《医宗金鉴ž外科心法要诀》中阐述：青蛇毒，此证又名青蛇便，生于小腿肚下，形长二三寸，结肿，紫块，僵硬[22]。其主要病机为热毒、水湿和血瘀阻于脉络。故中医治疗以清热利湿、活血化瘀为主。脉络舒通丸由黄芪、金银花、黄柏、苍术、薏苡仁、玄参、当归、白芍、水蛭、蜈蚣、全蝎、甘草组成，具有清热解毒、化瘀通络、祛湿消肿之功效，切中STP湿热浊瘀阻络的基本病机[23]。然而，脉络舒通丸抗STP的作用机制尚未完全明确。
本研究采用网络药理学整合体内实验的方式从多靶点、多角度、多途径揭示脉络舒通丸抗STP的作用机制，探讨脉络舒通丸抗STP的潜在靶点和分子机制。网络药理学结果显示，共筛选出脉络舒通丸145个活性成分及1112个成分作用靶点，837个STP疾病作用靶点，2者共同靶点共84个；将84个共同靶点导入STRING数据库中，隐藏孤立靶点，进行PPI网络分析，共筛选得到31个脉络舒通丸抗STP的核心靶点，经KEGG通路富集分析脉络舒通丸抗STP主要涉及PI3K/Akt、JAK/STAT、VEGF、流体剪切应力和动脉粥样硬化等介导的信号通路。研究发现，PI3K/Akt和JAK/STAT信号通路是与炎症反应和血栓形成密切相关的信号通路，且这2条信号通路的相关研究较多，P值排名较小。因此，本研究基于PI3K/Akt和JAK/STAT 2条信号通路深入探讨脉络舒通抗STP的作用机制。
PI3K/Akt信号通路是重要的细胞内信号转导通路，已被报道在结肠炎、关节炎、脑缺血再灌注损伤的炎症反应中发挥重要作用[24]。PI3K是一种由调节亚基p85和催化亚基P110构成的异源二聚体，调节亚基p85可通过SH2结构与磷酸化的酪氨酸残基作用，激活PI3K，进而增加3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）的产生，PIP3能够使PI3K下游关键靶蛋白Akt的Thr308、Ser473残基磷酸化并使其活化，活化的Akt可调控下游多种靶蛋白介导的生物过程，包括炎症反应和内皮损伤等[25-27]。研究发现，豨莶草水煎液可通过调控PI3K/Akt信号通路抑制NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，从而改善脑缺血再灌注损伤模型大鼠的炎症反应[28]。此外，PI3K/Akt信号通路也可介导依赖凝血酶的血小板信号转导，调控蛋白酶活化受体表达进而抑制血小板活化及黏附，延迟血栓的形成[29]。研究表明，水溶性番茄浓缩物通过抑制PI3K/Akt信号通路发挥抗血小板聚集和血栓形成的作用[30]。因此，本研究应用Western blotting技术检测各组兔耳组织中PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白的表达水平，结果显示脉络舒通丸能明显下调PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平，表明脉络舒通丸可能通过调控PI3K/Akt信号通路来发挥抗STP作用。
JAK/STAT信号通路主要通过多种细胞因子介导调节细胞增殖、凋亡及炎症反应。JAK2/STAT3是在炎性疾病中研究较多的信号通路，且JAK2特异性激活STAT3[31]。当受到外界信号刺激时，干扰素等配体与细胞膜上多种细胞因子受体结合，以同源或异源二聚体的形式磷酸化JAK2，磷酸化的JAK2随即募集细胞质中的STAT3，磷酸化后的STAT3形成二聚体进入到细胞核，最终与目的基因启动子相结合，调控血管内皮细胞功能及炎症反应等生物过程[32]。研究表明，白藜芦醇可通过抑制JAK2/STAT3通路，下调TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，减轻ApoE−/−小鼠动脉血管内的炎症损伤[33]。AG490（一种JAK2/STAT3信号通路的专效抑制剂）可显著抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤，其作用机制是通过阻断JAK2/STAT2信号通路，维持血管内皮细胞的稳态[34]。此外，AG490也可通过阻断JAK2/STAT3信号通路，抑制月桂酸钠溶液诱导的血栓闭塞性脉管炎大鼠的炎症反应和血栓形成[35]。故本研究应用Western blotting技术检测各组兔耳组织中JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达水平，结果显示脉络舒通丸可显著下调JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平，表明脉络舒通丸也可能通过调控JAK/STAT信号通路来发挥抗STP作用。
综上所述，本研究通过网络药理学方法预测了脉络舒通丸抗STP的作用机制，并进一步通过体内实验探讨其潜在的作用机制。结果表明，脉络舒通丸可抑制STP模型兔血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，并显著改善STP模型兔的病理损伤。其作用机制可能通过抑制PI3K/Akt和JAK2/STAT3 2条信号通路的激活，并下调多种炎症因子表达水平来发挥抗STP作用，为临床脉络舒通丸治疗STP提供坚实的理论基础和实验依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：曹宁宁，李市荣，王清果，王 伟，孙成宏，姚景春，张贵民，肖学凤．基于网络药理学整合体内实验探究脉络舒通丸抗血栓性浅静脉炎的作用机制 [J]. 中草药, 2023, 54(6):1860-1869.
转自：“如沐风科研”微信公众号
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