作者：宋培哲
近日，北京大学化学与分子工程学院贾桂芳课题组在Genome Biology期刊上发表了题为 “m6A readers ECT2/ECT3/ECT4 enhance mRNA stability through direct recruitment of the poly(A) binding proteins in Arabidopsis” 的研究论文。该论文揭示了RNA甲基化修饰（m6A）结合蛋白ECT2/ECT3/ECT4通过结合PAB蛋白协同促进靶向基因稳定性，进而调控ABA响应的分子机制。N6-甲基腺嘌呤（m6A）是mRNA上丰度最高的化学修饰，普遍存在于动物、植物、真菌以及RNA病毒之中。m6A可以分别在甲基转移酶复合物和去甲基酶的作用下被可逆地添加和去除，并由m6A结合蛋白识别并影响RNA代谢的各个方面。尽管m6A相关蛋白在哺乳动物中已经被充分地鉴定及表征，但m6A在植物中的调控功能研究仍十分有限。
此前的研究鉴定ECT2、ECT3、ECT4以及CPSF30-L为拟南芥中m6A结合蛋白，其中CPSF30-L通过识别m6A调控选择性多聚腺苷酸化（Alternative polyadenylation, APA）从而影响开花，脱落酸（Abscisic acid, ABA）响应以及氮素代谢 [1, 2]。而ECT2、ECT3、ECT4在叶片生长，器官生生，表皮毛分叉中均具有显著的冗余调控功能 [3-6]。尽管近期研究发现ECT2和ECT3的靶向底物具有很高的重复度，ECT2通过影响基因稳定性调控表皮毛表型 [5]，但是关于 ECT2、ECT3 和 ECT4 的具体协同调控基因表达以及影响后续表型的分子功能仍未得到明确的解答。
本研究首先通过酵母双杂、双分子荧光互补以及体外pull-down实验证明了ECT2、ECT3、ECT4两两之间相互作用形成一个复合物。并且通过体内RNA免疫共沉淀实验证实，这三个m6A结合蛋白复合物的形成可以更有效地的结合m6A（图1），从而协同调控后续的基因表达。
图1 ECT2、ECT3、ECT4相互作用增强结合m6A修饰基因
随后为了更好地解析ECT2/ECT3/ECT4的调控机制，该研究分别从转录以及转录后层面上检测了它们在APA，翻译以及稳定性上的调控作用，并最终发现ECT2/ECT3/ECT4更多地结合半衰期更长的基因，并同时促进靶向m6A修饰基因的稳定性（图2）。值得一提的是，此前哺乳细胞中的研究发现m6A主要被YTHDF2蛋白识别并执行降解功能。虽然ECT2/ECT3/ECT4同样含有YTH结构域，本研究的发现，揭示了植物中一种全新的m6A介导的基因表达的分子机制。
图2 ECT2/ECT3/ECT4促进靶向底物的稳定性
鉴于m6A结合蛋白功能的发挥一般依赖其互作蛋白，该研究通过体内蛋白免疫共沉淀鉴定到了PAB2与PAB4为ECT2的互作蛋白，体外生化实验以及数据分析进一步证实了ECT2通过自身的PrLD与它们相互结合，识别共同底物基因，从而实现靶向基因稳定性的协同正向调控（图3）。
图3 ECT2募集PAB2、PAB4蛋白协同调控靶向基因稳定性
该研究还发现ECT2、ECT3 和 ECT4 在非生物胁迫ABA响应中依赖m6A发挥重要作用，其在表型上表现为ECT2、ECT3、ECT4蛋白的丧失会导致ABA超敏感表型。后续的机制分析发现，ect2/3/4突变体通过影响下游ABA调控基因DWA1、DWA2、CPN20、SDIRIP1的稳定性以及表达丰度，进而调控下游ABI5的基因表达水平以及蛋白丰度，从而导致ABA超敏感表型（图4）。
图4 ECT2/ECT3/ECT4促进DWA1、DWA2、CPN20、SDIRIP1稳定性调控ABA响应
综上所述，该研究发现ECT2、ECT3 和 ECT4 通过蛋白-蛋白相互作用形成复合物，并增强其结合m6A修饰mRNA的结合能力。机制上，ECT2 通过募集 PAB2 和 PAB4 蛋白，协调维持其共同靶标mRNA的稳定性。在ABA刺激下，ECT2/ECT3/ECT4 的缺失会破坏DWA1、DWA2、SDIRIP1 和 CPN20 转录本的稳定性，从而促进 ABI5 的积累并调节 ABA 介导的种子萌发和萌发后生长（图 5）。
图5 ECT2/ECT3/ECT4正向调控靶向基因稳定性的作用机制
参考文献：
1. Song P, Yang J, Wang C, Lu Q, Shi L, Tayier S, Jia G: Arabidopsis N6-methyladenosine reader CPSF30-L recognizes FUE signals to control polyadenylation site choice in liquid-like nuclear bodies. Mol Plant 2021, 14:571-587.
2. Hou Y, Sun J, Wu B, Gao Y, Nie H, Nie Z, Quan S, Wang Y, Cao X, Li S: CPSF30-L-mediated recognition of mRNA m6A modification controls alternative polyadenylation of nitrate signaling-related gene transcripts in Arabidopsis. Mol Plant 2021, 14:688-699.
3. Arribas-Hernández L, Bressendorff S, Hansen MH, Poulsen C, Erdmann S, Brodersen P: An m6A-YTH Module Controls Developmental Timing and Morphogenesis in Arabidopsis.Plant Cell 2018, 30:952-967.
4. Arribas-Hernández L, Simonini S, Hansen MH, Paredes EB, Bressendorff S, Dong Y, Østergaard L, Brodersen P: Recurrent requirement for the m6A-ECT2/ECT3/ECT4 axis in the control of cell proliferation during plant organogenesis. Development 2020, 147.
5. Wei LH, Song P, Wang Y, Lu Z, Tang Q, Yu Q, Xiao Y, Zhang X, Duan HC, Jia G: The m6A Reader ECT2 Controls Trichome Morphology by Affecting mRNA Stability in Arabidopsis.Plant Cell 2018, 30:968-985.
6. Scutenaire J, Deragon JM, Jean V, Benhamed M, Raynaud C, Favory JJ, Merret R, Bousquet-Antonelli C: The YTH Domain Protein ECT2 Is an m6A Reader Required for Normal Trichome Branching in Arabidopsis.Plant Cell 2018, 30:986-1005.
北京大学化学与分子工程学院贾桂芳研究员为本文的通讯作者，博后宋培哲、已毕业博士生魏连环和博士研究生陈子昕为并列第一作者。此研究得到了科技部、国家自然科学基金委、北京大学及北京分子科学国家研究中心的资助。
贾桂芳研究员课题组聚焦“RNA修饰化学生物学和RNA表观遗传学”，开发RNA修饰化学标记测序技术；运用分子生物学、细胞生物学、生物信息学等技术和手段，研究RNA修饰在动植物中的生物调控功能；探索RNA修饰对植物增产的应用潜力，为育种提供新手段，推动植物RNA修饰领域。研究结果发表在Nature Biotechnology、Nature Chemical Biology、Nature communication、Genome Biology、Molecular Plant、Plant Cell、Angewandte Chemie International Edition、Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America等刊物上。实验室长期招聘博士后，欢迎优秀博士毕业生加入！
课题组主页：
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