NBT | 使用CRISPR相关转座酶在没有双链断裂的情况下实现基因敲入

由 CRISPR-Cas 系统编码的 RNA 引导的 DNA 核酸内切酶提供了易于编程和高效的活性，因此在基础研究、农业应用和人类治疗中得到广泛采用。在哺乳动物细胞中，Cas9 介导的双链断裂 (DSB) 主要通过两种方式进行修复——非同源末端连接 (NHEJ) 和同源定向修复 (HDR)。NHEJ 的效率通常超过 HDR至少一个数量级。虽然改进的基于 HDR 的插入方法已经开始出现，但需要更大尺寸的精确修改仍然效率低下且难以生成。

最近的研究进一步证实了基于 DSB 的基因组编辑的副作用，包括大规模基因组缺失、染色体易位和染色体碎裂。下一代编辑技术，包括base editor和prime editor，可实现精确的、不依赖于 DSB 的修饰。然而，这两种方法传统上都仅限于编辑范围从单个到 ~50 个碱基对 (bp)，导致无法访问更大的插入。最近开发的将 prime editor与丝氨酸整合酶相结合的工具，如 TwinPE 和 PASTE，已被证明能够插入更大的 DNA，效率高达 ~25%，但这些方法仍然需要解决复杂的 DNA 中间体，可能会在当多个酶促事件未同时发生时，目标位点产生不完整的修饰。最近的研究试图通过将 Cas9 融合到各种转座酶域来设计 RNA 引导的转座酶，但这些努力仍然依赖于 DSB 和/或未能实现严格的特异性控制。相比之下，细菌 CRISPR 相关转座酶 (CAST) 可以在没有 DSB 的情况下以靶向方式催化大 DNA 序列的插入。

近日来自于哥伦比亚大学Samuel H. Sternberg教授课题组在Nature Biotechnology上发表题为“Targeted DNA integration in human cells without double-strand breaks using CRISPR-associated transposases“的文章，报道了利用 RNA 引导的转座酶在哺乳动物细胞中进行靶向 DNA 整合的研究。

细菌 Tn7 样转座酶已选择至少三种不同类型的核酸酶缺陷型 CRISPR-Cas 系统用于 RNA 引导的转座（I-B、I-F 和 V-K），每一种都具有独特的特征。作者仔细审查了实验表征的 CAST 系统的保真度和可编程性参数，以及最近描述的 Cas9-转座酶融合方法，并选择将工作重点放在 I-F 型霍乱弧菌 CAST（VchCAST；以前也称为 VchINTEGRATE）上。在该系统中，包含 TniQ 和Cascade (VchQCascade) 的核糖核蛋白复合物执行 RNA 引导的 DNA 靶向，从而定义转座子 DNA 插入位点。在预先募集 AAA+ ATP 酶 TnsC后，异聚体 TnsA–TnsB 转座酶催化切除和整合反应。整合的 DNA 有效载荷必须位于转座子左右末端序列的两侧，这些序列编码 TnsB 结合位点并定义移动元件的边界。作者采用了一种自下而上的方法将 VchCAST 移植到人体细胞中。为了确定组成部分是否有效表达，作者将每个蛋白质编码基因克隆到具有 N 端或 C 端核定位信号 (NLS) 和 3×FLAG 表位标签的标准哺乳动物表达载体上（图 1）。通过一系列实验，作者验证了来自 VchCAST 的所有蛋白质和 RNA 成分的表达。

作者接下来关注 QCascade 靶向 RNA 引导的 DNA 的功能重建。与大多数 II 型和 V 型 CRISPR-Cas 系统编码的单个效应蛋白充当 RNA 引导的 DNA 核酸酶（分别为 Cas9 和 Cas12）不同，I 型系统编码的级联复合物（Cascade complex）不具有 DNA 切割活性，相反，在 R 环形成时表现出长寿命的靶 DNA 结合，类似于催化失活的 Cas9 (dCas9)。我们决定通过将转录激活因子与 QCascade 融合来利用此活动来转录激活 mCherry 报告基因，就像最近对其他 I 型系统所做的那样，从而将 DNA 结合转化为可检测信号，从而可以轻松地排除故障和优化QCascade 函数。作者通过实验证明了QCascade 和 TnsC 作为转录激活因子发挥作用。

在使用 eCAST-2.2 优化游离质粒 DNA 整合后，作者接下来将注意力转向了将 RNA 引导的整合重组到内源基因组位点。他们首先通过质粒到质粒整合分析筛选了一组靶向 AAVS1的指导序列，其中将源自 AAVS1 的 32-bp 靶位点克隆到 pTarget 中，并利用现有分析来鉴定两个优于crRNA原始质粒特异性 crRNA。当我们使用嵌套 PCR 策略测试 AAVS1 基因座的基因组整合时，他们确定了 RNA 引导的 DNA 整合产物，这些产物再次保持与目标位点的预期 49-bp 距离依赖性（图 2a）。然而，检测通常在生物复制之间不一致，这表明整合效率与我们的检测极限不谋而合。因此，我们应用了在我们之前基于质粒的测定中建立的基于 NGS 的扩增子测序方法，产生了大约 0.005% 的可重复效率（图2b）。

AAVS1 位点的个位数基因组整合效率使得能够探索 eCAST-3 设计和递送的其他参数。作者发现 crRNA 在质粒和基因组靶标上与 33-nt 间隔物一起发挥最佳作用，并且可以通过将 U6 驱动的 crRNA 盒直接放置在 pDonor 上来简化转染，而不会对活性产生不利影响。最后，作者重新访问了人类基因组中先前的目标位点并评估了整合效率以测试 ClpX 增强的普遍性。引人注目的是，作者观察到所有测试基因座的整合效率增加了 10-600 倍，并且一致偏好插入 crRNA 匹配目标位点下游约 49bp。

该工作利用 I 型 CRISPR-Cas 系统进行真核基因组和转录组工程的研究，挑战了对单效应编辑试剂的依赖，并为使用 RNA 引导的CRISPR相关转座酶进行基因组工程提供了一个强有力的起点。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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