Nature Communications | 不同肿瘤类型对PD-L1阻断反应的分子决定因素

本期iProteome为大家带来的是Barts癌症研究所Thomas Powles教授等发表在Nature Communications的文章，题为“Molecular determinants of response to PD-L1 blockade across tumor types”。该研究在分子层面揭示不同肿瘤之间对免疫治疗响应存在异质性，在进行免疫治疗决策之前需要考虑肿瘤的分子异质性。

撰文|马发含研究背景

最近，靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）和程序细胞死亡蛋白1（PD-1）或其配体PD-L1的免疫检查点抑制剂（CPI）在黑色素瘤、NSCLC、mUC和RCC等多癌症类型中具有很好的临床效果。然而，只有一小部分患者能从中获益，同时目前的预测标志，例如TMB、PD-L1表达或肿瘤微环境中的免疫浸润水平等，不能很好地预测免疫治疗的响应。所以需要新的生物标志物来预测对CPI的疗效，并为免疫治疗耐受的患者提供联合治疗策略。该研究中，作者通过366名癌症患者的转录组数据、PD-L1 IHC结果和TMB，鉴定了肿瘤中预测免疫检查点抑制剂响应的分子，并在通路水平上发现不同肿瘤之间存在异质性，尤其是PD-L1阳性的肿瘤。另外作者在mUC和NSCLC中发现细胞周期和DNA损伤修复基因与检查点抑制的响应有关，包括CDK4/6抑制剂CDKN2A，该发现表明非免疫途径与检查点抑制之间存在关联。

研究结果
1. 患者的临床特征

作者分析了来自三项atezolizumab（阿替利珠单抗）单药治疗研究，包括208名局部晚期/转移性mUC患者、81例局部晚期/转移性NSCLC患者和77例未经治疗的晚期/转移性RCC患者。通过实体瘤反应评估标准来评估客观缓解率（ORR），患者分为响应（完全缓解：CR/部分缓解：PR）或无响应（疾病稳定：SD/疾病进展：PD）。3种肿瘤中的ORR无显著差异，在mUC、NSCLC和RCC中，ORR分别为21.6%、13.6%和19.5%。

2. PD-L1 IHC结果和肿瘤突变负荷分析

作者首先评估了PD-L1和TMB在肿瘤中的分布，其中366例患者的PD-L1 IHC结果表明,在mUC、NSCLC和RCC中PD-L1阳性的比率分别为74.0%、70.4%和62.3%。在三种肿瘤中，PD-L1阳性肿瘤中的响应患者比例显著增加；接着评估了PD-L1的预测能力，它虽然具有较好的灵敏度(83.1%)，但是特异性较低（32.2%），说明需要其它标志物作为补充。

接着作者通过246个样本（144 mUC、50 NSCLC和52个RCC）的全外显子组测序（WES）评估TMB。与TCGA的研究结果一致，mUC和NSCLC的TMB明显高于RCC；mUC中应答者的TMB显著较高，并且在NSCLC中观察到相同趋势（p = 0.15）。但是，RCC反应组间未观察显著差异。按照TMB将肿瘤分为TMB高和TMB低的组，在临界值下，TMB预测治疗响应的总体敏感性和特异性分别为70.6%和55.4%（mUC：79.4%/47.3%；NSCLC：66.7%/56.1%；RCC：37.5%/75.0%），在mUC中灵敏度最高。

当PD-L1和TMB联合比较时，PD-L1阳性和TMB高肿瘤占84.1%，其中51个是响应的患者。31个（60.8%）是PD-L1阳性并且TMB高，10个（19.6%）仅为PD-L1阳性，5个（9.8%）仅为TMB高。另外5例（9.8%）响应都是PD-L1阴性和TMB低。结果表明利用PD-L1表达和TMB联合能够区分出大多数应答者，提高了检测灵敏度。但是，PD-L1阳性和/或TMB高肿瘤还包括161/195（82.6%）无响应患者，说明这些分组检测特异性较差。同时，在所有肿瘤中都可以观察到假阳性和假阴性，这表明其中具有某些肿瘤特异性应答机制，突出了鉴定更准确生物标志物的必要性。

3. 治疗前肿瘤的转录图谱    为了发现除PD-L1和TMB之外的标志物，作者通过治疗前肿瘤样本的的转录组数据。PCA显示，样本主要按肿瘤类型聚类，在mUC和NSCLC肿瘤之间观察到重叠，而RCC肿瘤离散地分布，这可能是由于组织特异性和肿瘤发生的不同机制导致。这些观察结果得到了PVCA的支持，其中癌症类型解释了数据总体方差的35%。对治疗反应的ORR仅解释了约1%的方差，这表明了肿瘤内在响应模式的差异。    为了解释三种癌症类型中富集的生物学通路，作者进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。在所有样本中，鉴定61个共表达基因的模块。通路富集和xCell分析发现，RCC肿瘤主要富集于T/NK细胞毒性、II型IFN信号传导/抗原呈递、血管生成和髓系炎症等特征，而NSCLC肿瘤在B/浆细胞和I型IFN特征中富集。mUC肿瘤富集于增殖和DNA损伤修复（DDR）特征，可能由于该肿瘤中具有较高的TMB。xCell分析进一步发现NSCLC中记忆B细胞、浆细胞和树突状细胞的增加，以及RCC中CD8+ T记忆细胞、NKT和巨噬细胞的增加。另外mUC和NSCLC中具有上皮细胞富集，而RCC肿瘤具有成纤维细胞和内皮细胞富集，表明基质和血管系统的上调。

总体而言，虽然这些肿瘤类型对PD-L1阻断表现出相似的反应率，但转录组分析发现它们具有不同的TME（肿瘤微环境），这些TME可能会影响对检查点抑制的反应机制。

4. 转录水平预测PD-L1阻断响应的性能

随后，作者通过机器学习来鉴定分子标志物组合，该组合可以预测治疗反应并作为PD-L1表达和TMB特征的补充。作者首先筛选了58个基因在366个II期试验样本中进行训练，并在PVD4989g独立队列中进行验证，结果显示这些特征在训练集中可以将响应者和非响应者分开。在POPLAR（NSCLC）的化疗（多西紫杉醇）组和IMmotion150（RCC）的酪氨酸激酶抑制剂（舒尼替尼）队列中进行验证，在应答者和非应答者之间未观察到显著差异，这表明该特征仅对atezolizumab的反应具有预测价值。

接着作者通过ROC曲线来表征这些分子组合、PD-L1 IHC和TMB以及它们联合的预测能力。在训练集中，这些分子组合表现出高准确性（AUC=0.99），而TMB（AUC=0.69）和PD-L1（AUC=0.60）的AUC都较低。在PD-L1和TMB之间没有观察到协同作用，这表明RNA-seq本身可以概括PD-L1表达和TMB背后的生物学机制。此外，作者还测试了先前五项研究的模型特征，这些特征的预测性能较差，最大AUC为0.60。然后，作者在PCD4989g队列中，发现所有测试的特征都显示出较低的预测能力，包括58个基因足组合（AUC<0.65）。另外采用不同的机器学习算法也得到相同的结果。这些发现表明，虽然机器学习方法可以在单个数据集中使用交叉验证来识别高度准确的特征，但在独立数据集中的验证仍然具有挑战性，并且可能被低样本量、癌症之间反应机制的异质性以及队列之间的临床差异所混淆。

5. 与PD-L1阻断响应相关转录特征    为了探索基因表达与治疗响应之间的关联，作者首先从模型中移除TMB以最大化样本功效，并将PD-L1表达和肿瘤类型作为协变量进行整合分析，其中只有32个基因在响应组中上调，59个基因下调，说明转录组与免疫治疗的ORR关联较低。    接下来在肿瘤的所有样品中进行模块富集分析，并没有发现与肿瘤的响应、PD-L1阳性或PD-L1阴性显著相关的单个模块，但是mUC和NSCLC肿瘤显示出比RCC肿瘤更多的相似性，这与它们转录组更相似一致。在联合分析中，作者发现响应肿瘤中富集ATP生物合成和氧化磷酸化，在mUC和NSCLC肿瘤中也富集了细胞周期/ DDR，可能反映了TMB增加与PD-L1阻断反应之间的关联。相反，与肿瘤生物学（WNT和PI3K-Akt）和基质生物学（TGF-β，胶原蛋白和细胞外基质）相关的模块在非响应组中富集；与mUC和NSCLC不同,RCC非响应组中富集代谢和骨髓炎症信号。

随后作者分析了PD-L1阳性和PD-L1阴性的肿瘤，结果显示治疗响应在转录组水平存在显著差异。在259个PD-L1阳性肿瘤中，没有单个模块在各个适应症中与ORR显著相关。在PD-L1 阳性mUC肿瘤中，只有细胞凋亡信号与反应相关；NSCLC以翻译途径为主；RCC骨髓炎症，WNT信号传导和胶原形成与ORR呈负相关。有趣的是，在107 PD-L1阴性的肿瘤中观察到更一致的信号。细胞周期/DDR与PD-L1阴性肿瘤的反应呈正相关。虽然这表明高TMB对响应的贡献，但DDR特征与TMB之间的相关性不大。

最后，作者通过xCell分析了ORR与免疫微环境的关联。各个肿瘤中没有发现与ORR一致的相关性；在mUC应答者中，Pro B细胞，pDC和嗜碱性粒细胞增加；NSCLC应答者中,DC、单核细胞和NKT细胞增加。而在RCC中，只有CD8 Tem细胞在应答者中增加。

这些分析提供了对PD-L1阻断反应机制复杂性的见解，突出了与各种肿瘤对PD-L1阻断的反应相关的通路的异质性，特别是在PD-L1阳性肿瘤中。这也说明与响应相关的转录特征似乎是多因素的，部分由肿瘤的组织学特征决定，也可能由表达PD-L1的各种细胞群决定。

6.CDKN2A活性在PD-L1阻断的响应者中上调    在与PD-L1阻断反应相关的基因中，CDKN2A上调最显著。CDKN2A编码p16（INK4A），这是一种细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6的内源性抑制剂，可防止G1/S相变并诱导细胞衰老。CDKN2A在许多肿瘤类型中经历拷贝数丢失，为了评估mUC、NSCLC和RCC中CDKN2A缺失率，作者在大肿瘤样本的数据库中进行分析，CDKN2A在几种肿瘤中表现出频繁丢失，包括UC（39%）、RCC（36%）和NSCLC（34%）。

接着作者评估了CDKN2A拷贝数改变与PD-L1阻断响应之间的关联，观察到CDKN2A丢失的肿瘤对PD-L1阻断反应降低，但在mUC和RCC中观察到显著关联，可能是由于样本较少。由于CDKN2A和CD274（编码PD-L1）都编码在9号染色体（chr9p）的p臂上，作者在FMI数据库中发现CDKN2A和CD274缺失的共同发生。作者还在三项研究的WES数据中发现了chr9p组的浅层缺失，并测试了这些缺失对CD274和CDKN2A表达和相关性的影响。在14.9%、19.5%和19.8%的POPLAR、IMvigor210和IMmotion150肿瘤中观察到浅层chr9p缺失，突出了不同肿瘤之间具有相似的chr9p缺失率。但是没有发现chr9p缺失状态与CD274或CDKN2A表达之间的强关联，这可能是由于非肿瘤细胞群对这些基因的转录表达的贡献。

最后，作者在mUC和NSCLC中分析了CDKN2A及其两个靶标CDK4和CDK6的转录水平与总生存期（OS）以及RCC的无进展生存期（PFS）之间的关联。结果显示在mUC和NSCLC中CDKN2A增加显著改善患者的生存，在RCC中PFS也得到改善。相反，CDK6升高与mUC中OS降低显著相关，在NSCLC中也存在相同的趋势，RCC中的PFS较低，而CDK4未观察到差异。

总而言之，作者综合这些结果以及最近几项将CDK4/6抑制剂与CPI相结合的临床前研究，说明了来自 mUC、NSCLC和RCC的患者的生物标志物选择性亚群也可能受益于同时靶向PD-L1和CDK4/6轴的联合治疗。

讨论
    在这项研究中作者将现有生物标志物与RNA-seq相结合，在572名接受阿替利珠单抗治疗的患者中，揭示了mUC、NSCLC和RCC肿瘤之间对免疫治疗响应具有分子异质性。通过机器学习并没有识别预测ORR的统一基因特征，可能是多种因素决定了对检查点阻滞的反应；免疫检查点抑制效果部分取决于肿瘤类型，突出了该领域生物标志物开发的难度。目前虽然可能存在对PD-L1阻断反应的通用生物标志物，但在进行肿瘤的免疫治疗时也必须考虑肿瘤的异质性，从而制定有效的联合治疗方案。

转自：医科研

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