基于酶促大环化的mRNA展示技术

英文原题：Enzymatic Macrolactamization of mRNA Display Libraries for Inhibitor Selection

供稿人：梁轩 北京大学

大家好，本期为大家分享一篇发表在ACS chemical biology上的文章，文章题目为“Enzymatic Macrolactamization of mRNA Display Libraries for Inhibitor Selection”，文章的通讯作者是来自北卡罗来纳大学教堂山分校的Albert A. Bowers副教授。在本文中，作者们开发了一种基于酶促大环化的mRNA展示文库构建策略，成功实现了靶标蛋白的特异性结合多肽筛选。

mRNA展示技术是一种新兴且强大的体外多肽筛选技术，其核心是借助嘌呤霉素形成mRNA-蛋白质复合物，将多肽表型筛选与基因型直接联系起来，广泛应用于高亲和力结合肽的筛选。增加mRNA展示文库的多样性对于提高筛选效率和扩大适用范围意义重大，目前常见的策略是使用遗传密码子重编程和生物正交反应等技术来扩展mRNA展示文库的多样性，而基于酶促反应的mRNA展示文库多样化策略目前仍鲜有报道。在该工作中，作者们尝试借助微生物谷氨酰胺转移酶(mTG)催化环肽形成的活性来构建环化肽mRNA展示文库，进而提高多肽筛选效率。微生物谷氨酰胺转移酶(mTG)是一种半胱氨酸蛋白酶，能够催化裂解谷氨酰胺侧链上的酰胺键，形成酶连接的硫酯，进而与氨基等亲核试剂反应（在蛋白中一般是赖氨酸残基上的ε氨基），从而形成异肽键，广泛应用于生物分子偶联和多肽环化。

图 1.mTG催化异肽键形成的反应示意图

为了将基于mTG的多肽环化技术应用于mRNA展示文库的构建，作者们分两步对mTG催化反应的底物耐受性等进行了评估。他们首先对mTG催化谷氨酰胺活化这一过程的底物耐受性进行评估，构建了与mRNA偶联且谷氨酰胺两侧三个残基随机突变的展示文库（XXX-Q-XXX），然后使用戊胺生物素探针捕获被mTG活化的硫酯中间产物，经由链霉亲和素富集后使用qPCR和NGS测序技术进行分析。结果表明：mTG可有效催化修饰偶联有mRNA的底物肽，且反应不存在明显的底物偏好性，具有较好的底物耐受性和较小的偏差。

图2. mTG催化谷氨酰胺活化的底物耐受性评估

之后作者们又评估了mTG催化赖氨酸-谷氨酰胺环肽化过程的底物耐受性。实验思路与上一步类似，先构建融合了生物素标签的Gln-Lys的肽底物库，使用mTG酶处理以实现环化，再借助胰蛋白酶蛋白酶消化去除未环化底物，最后借助链霉亲和素回收用于qPCR和NGS分析。为了充分评估该酶促环化过程中的底物耐受性，他们构建了NNK4(Q-XXXX-K)和NNK6(Q-XXXXXX-K)两个随机文库，结果分析证明：mTG催化环肽形成具有良好的底物耐受性，不存在会影响后续筛选的明显底物偏差，可进一步用于mRNA展示文库构建和特异性多肽筛选。

图3. mTG催化赖氨酸-谷氨酰胺环肽化的底物耐受性评估

接着作者在两个实际的例子中使用基于mTG的环肽化mRNA展示文库进行了多肽筛选。第一个靶标是钙整合素结合蛋白1(CIB1)，该蛋白有一个很深的配体结合口袋，是重要的癌症治疗靶点。作者们使用与之前类似的策略构建了NNK6和NNK9两个随机mRNA展示文库，用mTG处理环化后对CIB1靶标进行了四轮筛选，最终富集得到了三类可能的候选肽家族。随后通过固相多肽合成制备了候选肽，并借助LC-MS和时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）进行实验验证，最后得到了纳摩尔级别的环肽抑制剂MWVLQYAHKLIKS(标红残基为环化位点)。进一步的圆二色性光谱和分子动力学模拟的分析表明，环化稳定了该多肽的α螺旋构象，对于其结合靶标蛋白CIB1的能力非常重要。最后作者们也尝试借助该策略筛选靶向免疫检查点蛋白B7-H3的环肽抑制剂，经过六轮筛选和实验验证，最终得到的B1.1多肽能够很好的靶向B7-H3，具有43.5 nM的结合亲和力，且环化对于该抑制剂的结合能力同样至关重要。

图4. 基于mTG酶促大环化mRNA展示技术用于CIB1结合肽筛选

简而言之，作者们将微生物谷氨酰胺转移酶(mTG)与mRNA展示技术相结合，借助mTG催化构建环肽展示文库，对两个重要靶标蛋白成功筛选出了的高效的环肽结合分子，表明基于该策略的mRNA展示筛选技术具有良好可行性和很大的应用潜力。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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