国自思路：外泌体、肿瘤微环境、成纤维细胞活化

编者按:对于肿瘤的发病基质，最初人们多聚焦于肿瘤细胞自身的分化、增殖和侵袭等，随着研究的深入，人们发现肿瘤细胞周围的基质细胞及其分泌的种种生长因子构成了肿瘤细胞微环境，在肿瘤细胞的发生发展中发挥重要作用，细胞间的信号转导都离不开肿瘤微环境的作用。成纤维细胞是最主要的肿瘤基质细胞，正常状态下，处于静息状态，而当受到损伤、炎症刺激或者在肿瘤状态下时处于被激活的状态，即活化的成纤维细胞参与肿瘤的发生发展  。这种肿瘤组织中的成纤维细胞，被称为肿瘤相关成纤维细胞（Tumor association fibroblasts, TAF）。成纤维细胞活化的标志性蛋白是成纤维细胞活化蛋白（fibroblasts activation protein, FAP）。肿瘤微环境中成纤维细胞活化是肿瘤发生发展的重要机制之一。肿瘤和成纤维细胞之间串扰机制如何？是深入探讨成纤维细胞活化机制的重要研究方向。下面这篇文章，从外泌体角度，探究了异质性肿瘤细胞与成纤维细胞之间的互作机制。

癌细胞周围复杂的肿瘤微环境

肿瘤相关成纤维细胞（CAF）等细胞组成的肿瘤微环境

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今天带来的思路来自广州医科大学第一附属医院妇产科于2021年3月17日发表在Oncogenesis上题为“Tumor-secreted exosomal Wnt2Bactivates fibroblasts to promote cervical cancer progression”的文章，即肿瘤分泌的外泌体Wnt2B激活成纤维细胞以促进宫颈癌的进展。

研究概述

基质成纤维细胞活化为癌症相关成纤维细胞 (CAF) 已被发现可能促进原发性肿瘤的生长和进展。然而，驱动基质异质性的肿瘤和成纤维细胞之间串扰的潜在机制仍然未知。作者的研究结果表明，宫颈癌 (CC)细胞来源的 Wnt2B 可以诱导成纤维细胞活化为 CAF，主要通过外泌体依赖性分泌，从而为 CC 进展的诊断和治疗靶点的开发提供方向。

研究思路

1、Wnt2B 表达与宫颈癌发生过程中的 CAF 丰度呈正相关

通过检测不同级别的宫颈发育不良和 CC中的α-SMA（CAF 标记物）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）（CAF 标记物）和波形蛋白（成纤维细胞标记物）水平发现，α-SMA和FAP在宫颈上皮内瘤变II-III（CIN II-III）（n = 32）和CC（n = 32）样本中的表达显著高于正常宫颈（n = 11）和CIN I 病变（n = 17）样本（图 1A ）。然而，基质波形蛋白的表达水平在任何宫颈标本之间没有显著差异，表明宫颈病变等级的恶性程度与 CAF 的数量之间存在直接关系。由于 Wnt2B 表达在宫颈癌发生过程中逐渐增加，并且与高危 HPV 感染呈正相关，但与年龄无显著相关性（图 1B-D）。α-SMA表达增加与肿瘤Wnt2B表达增加呈正相关（图1C、E）。肿瘤附近的成纤维细胞中也有高水平的 Wnt2B；统计分析显示，Wnt2B在肿瘤和基质中的表达呈正相关（图1F），表明肿瘤来源的Wnt2B向基质的转移可能有助于CC中的CAF积累.

2、Wnt2B 在 CC 细胞分泌的外泌体中高度富集

细胞裂解物和外泌体的蛋白质印迹结果显示，与人宫颈上皮细胞系 (HCerEpiC) 相比，所有 CC 细胞系均显示出更高的 Wnt2B 表达。此外，Wnt2B 存在于外泌体部分中，并且在 CC 细胞分泌的外泌体中比细胞裂解物中更富集（图 2A）。透射电子显微镜（TEM）证实 CC 细胞分泌的外泌体的形态为直径为 30-100 nm 的盘状囊泡状结构（图 2B ）。 Wnt2B 和外泌体标记物（CD63 和 CD81）检测证实外泌体是从过度表达 Wnt2B 的 SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B/ME180-Wnt2B 细胞中分离出来的（图 2C ）。使用酶联免疫吸附测定 (ELISA) 和蛋白质印迹法测定条件培养基 (CM) 中的 Wnt2B 水平，超速离心过夜（160,000 × g）后，SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B/ME180-Wnt2B细胞的CM中的Wnt2B水平低于对照组（图2D、E ）。此外，用 GW4869（一种阻断外泌体分泌的 N-SMase 抑制剂）处理 SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B/ME180-Wnt2B 细胞，增加细胞内 Wnt2B 水平，但与二甲基亚砜（DMSO）组相比，CM Wnt2B 水平显著降低（图 2F、G ），表明 Wnt2B 主要存在于 CC 细胞分泌的外泌体中。

3、Wnt2B可以通过CC细胞分泌的外泌体转移到成纤维细胞

与 SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B/ME180-Wnt2B 细胞共培养 48 h 后，共聚焦成像显示绿色（标记的外泌体）和 mCherry（标记的 Wnt2B）荧光点共定位于受体 NF（图 3A）。此外，与用 GW4869 预处理的那些相比，与 SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B/ME180-Wnt2B 细胞的 CM 孵育的 NFs 中的 Wnt2B 表达更高（图 3B、C）。这些结果表明 Wnt2B 可以通过外泌体从 CC 细胞水平转移到 NFs。

4、外泌体 Wnt2B 在体外和体内促进成纤维细胞活化

蛋白质印迹分析显示，在用含有 Wnt2B 的 CC 细胞分泌的外泌体处理的 NF 中，α-SMA 和 FAP 的表达水平显著高于其他组（图 4A，左图）。使用 GW4869 阻断外泌体分泌可以抑制由 SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B/ME180-Wnt2B 细胞的 CM 诱导的 CAF 标志物的上调（图 4A，右图）。使用伤口愈合、Transwell 和 CCK8 发现，在用 CM 或含有 Wnt2B 的外泌体处理的 NF 中观察到迁移和增殖增加（图 4B-F），而 GW4869 减轻了这些影响。将 SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B/ME180-Wnt2B 与成纤维细胞一同注射到雌性裸鼠皮下，与 DMSO 处理组相比，用 GW4869 阻断外泌体分泌显示活化成纤维细胞的浸润显著减少，这与体外观察到的相同。总之，这些结果表明外泌体 Wnt2B 是一种由 CC 细胞分泌的新型高效调节剂，可以驱动 NF 转化为 CAF。

5、外泌体 Wnt2B 激活成纤维细胞中的 Wnt/β-catenin 信号传导

与来自 NC 和 SiHa-shWnt2B/Hela-shWnt2B 细胞的外泌体不同，SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B 细胞分泌的外泌体显著增加了总的核积累，特别是成纤维细胞中非磷酸化 (nonP) β-catenin 水平（图5A、B）。同时，GW4869 处理消除了由 SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B 细胞的 CM 诱导的 Wnt/β-连环蛋白途径激活（图 5A）。在外泌体处理前用 HY-15597（一种有效的 Wnt 信号传导抑制剂）连续处理成纤维细胞 24 小时发现，HY-15597 处理降低了成纤维细胞中α-SMA、FAP 以及总和非 P-β-catenin 的表达，表明 Wnt/β-catenin 信号传导的激活是外泌体 Wnt2B 诱导 CAF 转化所必需的。图 5C)。这些发现表明外泌体 Wnt2B 通过 Wnt/β-catenin 途径促进成纤维细胞活化。

6、循环外泌体 Wnt2B 与成纤维细胞活化有关

为了研究癌细胞分泌的 Wnt2B 是否存在于 CC 患者的血清中，我们从 CC 患者（FIGO 2018，I-II 期，n = 8）和健康对照（n = 4）。从血清样品中纯化的外泌体的典型形态和大小范围与从培养上清液中纯化的外泌体一致（图 6A）。 Wnt2B 主要富集在血清外泌体中，而在 CC 患者中检测到的血清外泌体 Wnt2B 水平高于健康对照组（图 6B）。来自 CC 患者的循环外泌体显示 NF 中 α-SMA、FAP 以及总/非 P-β-连环蛋白的表达水平增加，而 HY-15597 减弱了这种作用（图 6C）。这些结果表明循环外泌体 Wnt2B 与 CAF 激活相关，这与 CC 细胞系中的观察结果一致。

7、外泌体 Wnt2B 激活的 CAF 促进体内肿瘤生长

皮下模型显示，与SiHa-NC/Hela-NC/ME180-NC预处理组或对照组相比，SiHa-Wnt2B/Hela-Wnt2B/ME180-Wnt2B预处理的CC细胞和NFs共同注射的小鼠肿瘤生长显著增加。这些数据证实外泌体 Wnt2B 激活的成纤维细胞在 CC 进展中发挥重要作用（图 7A-C）。

总的来说，作者提出了一个模型来总结研究中的观察结果（图 7D）。 CC细胞分泌的外泌体Wnt2B通过激活Wnt/β-catenin信号促进CAF转化，进一步促进基质重塑和癌症进展。

转自：“学术查”微信公众号

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