2022/10/28 15:52:55 阅读：175 发布者：
轻则眉头一皱，重则令人休克昏厥，疼痛的感觉与生俱来。研究表明，全球每年有数以千万计的中度至重度疼痛患者没有得到有效的镇痛治疗。同时，全球20%的人口在忍受着慢性疼痛，患者的生理和心理均受到极大的伤害，生存质量显著降低。在这种情况下，即使从人道主义角度来看，止痛药也显得尤为重要。阿片类药物一直是最有效也最常用的治疗中度至重度疼痛的药物，然而，伴随着阿片类药物的滥用，其不良反应如成瘾性、药物中毒等，所导致的问题亦在全球范围内不断凸显。由此，低毒无依赖的非阿片类药物的研发迫在眉睫。
上腺素能受体 (α2AAR) 是一种A类G蛋白偶联受体 (G-protein coupled receptor, GPCR)，其在中枢神经系统中的激活具有缓解疼痛的效果。同时也是非阿片类药物的一个靶向受体，例如右美托咪定 (dexmedetomidine)1。尽管该药物在治疗疼痛方面优势较大，但其强镇静作用和缺乏口服剂限制了其作为止痛药物的广泛应用。由于α2AAR能够结合下游多种信号蛋白（如G 蛋白， 抑制蛋白arrestin等）， 从而产生不同的生理效应（如镇痛、镇静作用）， 因此开发一种结构不同于可乐定、右美托咪啶等传统咪唑类药物且能选择性激活下游特定信号通路的新型激动剂，可能会降低或消除其镇静作用，从而作为非阿片类镇痛药而得到应用。
2022年9月30日，德国埃尔朗根-纽伦堡大学Peter Gmeiner实验室与美国加州大学Brian Shoichet实验室以及香港中文大学杜洋实验室合作，在Science期刊上发表了题为Structure-based discovery of nonopioid analgesics acting through the α2A-adrenergic receptor的论文。文章将超过三亿个小分子的虚拟文库与α2BAR进行分子对接，筛选到两个小分子“9087”和“PS75”，EC50分别为52nM和4.8nM。这两个小分子均具有很好的止疼效果，且与传统止疼药右美托咪定相比，新化合物剂量即使大大高于缓解疼痛所需的剂量都没有产生镇静作用，展现出丰富的成药潜力。
ZINC15和ZINC20虚拟文库由数百万到数十亿个分子组成，考虑到α2BAR正构位点尺寸较小，研究者从ZINC15文库中对接了2000万个片段状分子 (< 250 amu) 和2.81亿个铅状分子 (250 ~ 350 amu)。DOCK3.7对超过233万亿个复合物（平均每个分子45.2万个）进行了采样，并使用其基于物理的能量函数进行了评分。合成了48个小分子——44个片段状分子和4个铅状分子，其中63%与α2BAR结合常数 (Ki) 值小于10 μM，化合物“9087”的Ki为1.7 nM；35%与α2AAR的Ki值在72nM到9.4 μM之间，亲和力最高的达到12 nM（图1A）。对评分最高的四种激动剂“9087”、“4622”、“2998”和“0172”进行Gαi生物发光共振能量转移 (BRET) 测定，α2AAR介导的Gi激活最大效应 (Emax) 在去甲肾上腺素反应的60 ~ 95%之间， EC50在9.7 ~ 210 nM之间（图1C）。
研究者进一步对“9087”进行优化，得到了两个优化的类似物“7075”和“PS75”。与抑制蛋白β-arretin-2的募集相比，筛选到的小分子对Gi激活有很强的差异活性。研究者发现，这种arrestin募集的缺失可能反映了新受体激动剂的部分激动作用，与良好耦合的Gi通路相比，arrestin通路耦合较弱。
图1.超大型文库对接筛选新型α2AAR激动剂
为了测试对接模型以及基于模板结构对小分子进行进一步优化，研究者使用Cryo-EM技术确定了“9087-α2AAR-GoA”和“4622-α2AAR-GoA”配合物的结构，分辨率分别为3.47和3.38 Å（图2）。基于结构中观察到的相互作用，以及研究残基突变对Gi激活和β-arretin募集的影响，研究者发现在F4277.39A突变体中，“9087”、“7075”和“4622”的Gi活性被消除，这可能表明“9087”的吡啶与F4277.39之间形成了阳离子-π相互作用。此外，之前已有研究表明，Y4317.43突变对去甲肾上腺素的β-arretin募集的影响大于Gi信号，因此提出激动剂和7.43位置的残基之间的直接氢键可以更紧密地耦合TM7，从而在β-arretin信号传导中发挥作用2。
综上所述，对残基取代的差异反应支持了结构上的建议，即新的激动剂虽然与经典激动剂结合在相同的位点上，但相互作用的方式截然不同，这对不同的受体信号传导具有潜在的意义。
图2. “9087-α2AAR-GoA”和“4622-α2AAR-GoA”复合物的冷冻电镜结构
为了优化“9087”，研究者采用了两种策略:
（1）首先，研究者使用经典的药物化学假设检验和类似物的生成来研究和优化关键识别残基。最终选择了“9087”类似物中的13个，干扰吡啶消除了Gi活性发现，阳离子的重要性以及与F4277.39形成氢键的重要性（图3A）。接着，研究者对“9087”进行了分子改造。其中，“7075”是最有效的激动剂（图3B），它优先激活Gi/o信号，而不是其他G蛋白亚型和β-arretin，没有引起受体内化。
（2）第二种配体优化策略是纯基于结构的，在类似物“5879”和“7075”的基础上，研究者专注于派生“9087”的亲脂性取代基，在“5879”双环部分的第5和第7位发现了配体和受体之间的未开发空间。研究者尝试用不同尺寸的取代基填充R1位置的“5879”。取代基由大到小依次为甲氧基 (PS71)、氯 (PS75) 和氟 (PS70)，仅有PS75对Gi的激活作用与“5879”相似（EC50值分别为4.8 nM和6.1 nM）。
PS75是第二轮优化中生成的最有效的激动剂。与“9087”相比，该分子是一种完全激动剂，对Gi的激活效率提高了11倍 (EC50 4.8 nM, Emax 82%)，并且比“9087”更有效地激活Gi/o/z亚型。与此同时，与其他G蛋白家族和β-arretin相比，PS75仍然保留了通过Gi/o的优先信号传导。在PS75的建模中，氯取代基朝向T1333.37的萘环下方的空隙（图3C）。
图3. 基于结构信息的 “9087” 优化
最后，研究者进行了激动剂的选择性和药代动力学特性研究。实验测定发现，新型激动剂具有较好的选择性和生理渗透性。基于此，研究者在全身给药后测试了新型镇痛激动剂（图4）。实验结果表明，新型激动剂在神经性和炎症性疼痛模型中起到抵抗异常疼痛的作用，并且能在正常动物中缓解急性伤害感受。最具有成药潜力的小分子是“9087”和“PS75”，它们不仅具有强烈的镇痛作用，并且优于右美托咪定的是，它们没有强镇静的副作用且可口服。
图4. 激动剂通过α2AAR对神经性、炎症性和急性热痛具有抗伤害性，但不具有镇静作用
总的来说，本项研究：
（1）直接从虚拟文库对接中发现了与传统激动剂无关的多种化学型通过α2AAR激动作用对神经性、炎症和急性疼痛模型有效。
（2）并且通过功能分析显示，与其他G蛋白亚型相比，“9087”及其类似物“7075”和“PS75”具有优先的Gi/o/z激活，无β-arretin活性。
（3）且与右美托咪定和可乐定不同，新型激动剂在镇痛剂量下不会引起镇静或运动损伤，这可能使其在疼痛治疗中得到更广泛的应用，并证明了α2AAR激动剂能够区分这两种作用。这些先导化合物为新型非阿片类药物疼痛疗法带来了新的曙光。
原文链接
https://www.science.org/doi/10.1126
/science.abn7065
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