STTT | 2篇！中南大学梁德生等团队使用基因编辑方法可潜在治疗血友病
2022/6/21 15:17:04 阅读：387 发布者：
血友病 A (HA) 是最常见的遗传性出血性疾病，每 5000 名男性新生儿中就有 1 人患病。 HA 患者患有自发性软组织和关节出血或危及生命的颅内出血。严重HA患者的主要临床治疗是终生维持蛋白质替代疗法，这会增加感染风险并诱导FVIII抑制剂。基因疗法有望治愈 HA，然而，目前基于 AAV 的基因添加策略受到其负载能力、衣壳的免疫原性和插入诱变风险的限制。
2022年6月20日，中南大学梁德生及周妙金共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=18）在线发表题为“Targeted B-domain deletion restores F8 function in human endothelial cells and mice”的研究论文，该研究在 HA-iPSC 中实现了有效的靶向 F8-B 缺失，并且衍生的 iEC 可以表达功能性 FVIII。用 F8-B 缺失的 iEPC 移植可以恢复 FVIII 功能并挽救 HA 小鼠的出血表型。这些发现为从具有靶向 B 结构域缺失的内源性 F8 生产功能性 FVIII 提供了概念证明，以及用于 HA 的自体干细胞基因治疗的临床前验证。
另外，2021年1月14日，中南大学梁德生及刘雄昊共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=18）在线发表题为“IL-24 armored CAR19-T cells show enhanced antitumor activity and persistence”的研究论文，该研究在CAR-T细胞中过表达具有强大和广谱抗癌效果的IL-24以获得增强的抗癌效果。结果表明，与CAR19-T细胞相比，CAR19-IL-24-T细胞表现出增强的抗肿瘤效率，同时具有抗凋亡特性，加强T细胞的增殖与持久性。此外，CAR19-IL-24-T细胞分泌额外的IL-24可作为协同抗肿瘤的有力武器。本研究提示CAR19-IL-24-T细胞具有临床转化应用潜力，为改进CAR-T治疗提供了一种新策略。
遗传上，HA 是由编码凝血因子 VIII (FVIII) 的 F8 突变引起的，F8 包括三个 A 结构域、一个 B 结构域（约 44% 的 FVIII）和两个 C 结构域。据报道，15-26% 的严重 HA 患者存在涉及编码 FVIII B 结构域 (F8-B) 的序列的突变，仅次于内含子 22 倒位突变 (45%)。值得注意的是，最终发挥凝血功能的 FVIII 不包含 B 结构域。近几十年来，开发了一种缺乏大部分 B 结构域 (BDD-FVIII) 的 FVIII，外源性 BDD-FVIII 或 BDD-F8 随后在 HA 患者的临床前研究或临床管理中似乎是安全有效的。FVIII 在 B 结构域内含有 19 个 N 连接的糖基化位点。由于内质网到高尔基体的转运增加，部分 B 域缺失的 FVIII 保留了几个 N 连接的糖基化位点，从而更有效地分泌。然而，尚不清楚具有部分或全部 F8-B 缺失的内源性 FVIII 是否保留凝血功能。最近，研究人员发现 F8-B 中 54 bp 缺失内的重构 F8 可以表达功能性 FVIII，因此假设对 F8 进行原位基因操作以产生完整的 F8-B 缺失可能代表所有具有 F8-B 突变的 HA 患者的治疗策略。在这里，该研究使用CRISPR/Cas9在 HA 患者衍生的诱导多能干细胞 (HA-iPSCs) 和正常人 iPSCs (N-iPSCs) 中评估了这种策略。HA-iPSCs 先前是从 HA 患者 (c.3167del CTGA) 的尿细胞中产生的。为了排除 CRISPR/Cas9 对融合序列（Ser743 与 Gln1638 融合）的重新切割，该研究保留了 Gln744 和 Asn745 的编码序列，以确保 Asn745 与 Pro1640 融合。双单向导 RNA (sgRNA) F8-BDU-sg1 和 F8-BDD-sg4 的设计验证了切割活性。将表达 CRISPR/Cas9 复合物和 sgRNA 的质粒连同相应的 ssODN 模板核转染到 HA-iPSC 和 N-iPSC 系中。该研究在没有任何筛选的情况下实现了 4.17% 的高靶向效率。稳定的 BDD-F8 克隆保持多能性和正常的核型。没有观察到脱靶插入缺失。检测到 BD-iPSC 的重构 F8 转录本；然而，在 iPSC 培养的上清液中几乎没有检测到 FVIII。蛋白质印迹显示几乎无法检测到凝集素甘露糖结合 1 (LMAN1) 水平，据报道其介导 FVIII 分泌。鉴于 EC 是分泌 FVIII 的主要细胞类型，该研究将 BD-iPSC 分化为 EPC/EC，并评估了 BD-iPSC 衍生的 EPC (BD-iEPC) 和 EC (BD-iEC) 中的 FVIII 表达。获得了表达 CD31 和 CD144 的纯 iEPC 和表达血管性血友病因子 (vWF) 的成熟 EC。该研究在 EC 中检测到 LMAN1，可能解释了为什么 FVIII 从 iEC 分泌而不是从 iPSC 分泌。这些结果证明了内源性 BDD-FVIII 在 BD-iEC 中的表达和分泌。为了确定内源性 N8-FVIII 的表达效率，该研究构建了一个原位部分 B 域缺失的 N8-FVIII 变体，在 N 末端含有 271 个氨基酸。以 14.58% 的效率获得了含有 N8-FVIII 变体的 iPSC。选择表达多能基因、维持正常核型和转录重组 N8-FVIII 的 N8-9-iPSCs 和 N8-46-iPSCs 克隆用于进一步的实验。N8-iPSCs 分化为 EPCs (N8-iEPCs) 和 ECs (N8-iECs)，其特征在于血管生成和 Dil-乙酰化-低密度脂蛋白内吞作用。在 N8-iECs 中检测到重构的 N8-FVIII 转录物，比 HA-iECs 高 8 倍，比 BD-iECs 高 3 倍。N8-9-iECs和N8-46-iECs上清液中的FVIII水平显著高于BD-iECs。同时，通过免疫染色证实了 N8-iECs 中 FVIII 的表达，并在 ECs 中检测到了 LMAN1。为了验证内源性 BD-FVIII 和 N8-FVIII 的治疗效果，该研究通过眶后静脉注射将 HA-iEPC、重构 iEPC 和 N-iEPC 移植到 HA 小鼠中。输注后 2 周，对 HA 小鼠进行尾夹攻击和血浆 FVIII 活性测定。移植BD-iEPCs和N8-iEPCs的HA小鼠的平均存活时间（分别为24.62 h和29.25 h）明显长于未处理小鼠（5.73 h）。值得注意的是，18 只移植了 BD-iEPC 的 HA 小鼠中的 3 只和移植了 N8-iEPC 的 18 只 HA 小鼠中的 3 只在尾夹攻击后 48 小时存活（实验终点）。
此外，该研究观察到移植 BD-iEPC 和 N8-iEPC 的 HA 小鼠的血浆 FVIII 活性（分别为 12.79% 和 10.49%）高于 HA 小鼠（3.88%）。这些结果表明，部分或全部缺失 F8-B 的内源性 FVIII 可以发挥凝血功能，系统输注重组 iEPC 可以挽救 HA 小鼠的 FVIII 缺乏。使用抗人 vWF 抗体的免疫染色，该研究在移植 iEPCs 的 HA 小鼠的肝脏中发现了阳性细胞，但在注射了 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 的小鼠中没有发现阳性细胞，并且在 iEPC-移植的小鼠 的肺和脾脏中观察到阳性信号，但不在心脏或肾脏中。此外，在为期 2 周的观察期内，未观察到对肝脏或肾脏的明显损害。总之，该研究在 HA-iPSC 中实现了有效的靶向 F8-B 缺失，并且衍生的 iEC 可以表达功能性 FVIII。用 F8-B 缺失的 iEPC 移植可以恢复 FVIII 功能并挽救 HA 小鼠的出血表型。这些发现为从具有靶向 B 结构域缺失的内源性 F8 生产功能性 FVIII 提供了概念证明，以及用于 HA 的自体干细胞基因治疗的临床前验证。https://www.nature.com/articles/s41392-022-01016-9https://www.nature.com/articles/s41392-020-00380-8
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