中国青年学者一作，Nature Materials！CAR-T细胞的原位PEG化！

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞免疫治疗在治疗许多癌症方面是有效的。然而，它经常诱发危及生命的细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性。近日，美国宾夕法尼亚大学Michael J. Mitchell及其团队发现聚乙二醇（PEG）原位偶联到CAR T细胞表面（PEG化）创造了一个聚合间隔物，阻止CAR T细胞、肿瘤细胞和单核细胞之间的细胞间相互作用。这种间隔阻碍了CAR-T细胞的密集肿瘤裂解和单核细胞激活，从而减少毒性细胞因子的分泌，减轻CRS相关症状。随着时间的推移，CAR-T细胞的缓慢扩张降低PEG表面密度，并恢复CAR-T细胞-肿瘤细胞之间的相互作用，从而诱导有效的肿瘤杀伤。这发生在CAR-T细胞-单核细胞相互作用恢复之前，为单核细胞过度激活之前的CAR-T细胞杀伤肿瘤打开一个治疗窗口。与治疗性抗体托珠单抗治疗相比，致命的神经毒性也较低，这表明CAR-T细胞的原位聚乙二醇化为更安全的细胞免疫治疗提供一种新策略。相关研究成果以“In situ PEGylation of CAR T cells alleviates cytokine release syndrome and neurotoxicity”为题于2023年9月11日发表在《Nature Materials》。

【PEG化作用在体外阻断细胞间的相互作用】

在图1a所示的培养条件下或活体动物中，二苯并环辛烯（DBCO）组与CAR-T细胞表面的叠氮化物基团发生反应。共聚焦图像显示，含有分子量（MW） 1K、5K、10K和100K PEG的PEG化的CAR-T细胞未能阻断CAR-T细胞、Raji肿瘤细胞和单核细胞之间的相互作用，而PEG MW为600K的PEG化的CAR-T细胞显著阻断所有细胞间的相互作用（图1b）。此外，PEG 600K修饰也降低靶肿瘤细胞的杀伤作用（图1c）。由活化的单核/巨噬细胞产生的细胞因子IL-6和由活化的CAR-T细胞产生的细胞因子TNF-α的水平也显著降低（图1d、e）。

图1 CAR-T细胞的PEG化改变细胞间的相互作用和细胞因子的释放

【PEG在体内CAR-T细胞表面】

然后研究Cy7标记的DBCO-PEG600K（DBCO-PEG600K-Cy7）的血液循环，发现DBCO-PEG600K-Cy7在正常小鼠的血液中有18 h的半衰期（图2a、b），注射后遍布全身（图2c）。本文还研究了DBCO-PEG600K-Cy7是否能在体内偶联到荧光团（CSFE）修饰的CAR-T-叠氮化物细胞上（图2d-i）。CAR T-CSFE细胞主要检测于肝、脾和淋巴结，这是肿瘤细胞定位的组织。在这些组织中检测到Cy7信号（图2d、e），表明DBCO-PEG600K-Cy7可能与CAR-t-叠氮化物细胞结合。流式细胞术显示，DBCO-PEG600K-Cy7在60 min范围内结合了血液循环、肝、脾和淋巴结中的CAR-T细胞（图2f-m）。这些结果表明，DBCO-PEG600K在体内可快速偶联到CAR-T-叠氮化物细胞上。

图2 DBCO-PEG600K与CAR-T细胞的体内结合

【CAR-T细胞的PEG化可减轻细胞因子释放综合征】

本研究建成CRS小鼠模型（图3a），通过静脉注射10mgkg−1 DBCO-PEG1K，未经修饰的PEG600K和DBCO-PEG600K到老鼠身上观察高热现象（图3b）。与输注PBS相比，DBCO-PEG1K和未经修饰的PEG600K治疗并不影响体重减轻、温度或细胞因子的释放；而DBCO-PEG600K治疗极大地逆转了体重减轻、高烧和细胞因子的释放（图3c-i）。同时还测量了小鼠血液中CAR-T细胞、肿瘤细胞和单核细胞的数量（图3j-l）。在DBCO-PEG1K-和未修饰的PEG600K处理的小鼠中，几乎所有的肿瘤细胞在CAR-T细胞给药后2-3天内被清除；而在用DBCO-PEG600K处理的动物中，肿瘤细胞清除明显延迟，但所有肿瘤细胞最终在CAR-T细胞注射后的第35天被清除（图3j、p、q）。随着肿瘤细胞的清除，在PBS、DBCO-PEG1K和PEG600K组中，CAR-T细胞和CD14+单核细胞数量快速增加，在用DBCO-PEG600K处理的小鼠中，CAR-T细胞和CD14+单核细胞的扩增大大减少（图3k、l）。从接受DBCO-PEG1K和未修饰PEG600K的小鼠中分离的CAR T细胞诱导大量Raji-Luc-GFP细胞裂解和细胞因子释放，而从DBCO-PEG600K处理的小鼠中收集的CAR T细胞没有导致高靶细胞杀伤和细胞因子释放（图3m-o）。这些结果支持DBCO-PEG600K诱导的CRS缓解，这是由于DBCO-PEG600K与CAR-T细胞结合而导致的CRS缓解。

图3 CAR-T细胞的原位PEG化可减轻细胞因子释放综合征

【CAR-T细胞的PEG化可减轻神经毒性】

本文研究DBCO-PEG600K注射液在治疗CRS症状和神经毒性方面是否比托珠单抗注射液具有优势（图4a）。结果发现托珠单抗和DBCO-PEG600K治疗都能极大地控制与CRS相关的症状，如高烧和体重减轻（图4b-d）。而在接受托珠单抗或DBCO-PEG600K治疗的小鼠中，肿瘤细胞被完全清除（图4e)，但只有DBCO-PEG600K治疗显著降低CAR-T细胞扩张水平和细胞因子的产生。托珠单抗和DBCO-PEG600K均保护小鼠免于CRS死亡率（图4f)，而不诱导严重毒性，但只有DBCO-PEG600K阻止小鼠发生致命的神经毒性（图4g)。PBS处理和托珠单抗处理的小鼠出现脑膜增厚和蛛网膜下腔的人单核细胞浸润（图4h)。只有DBCO-PEG600K显著延长小鼠的存活时间（图4i）。这些数据表明，DBCO-PEG600K可以保护小鼠免受托珠单抗无法保护的严重神经毒性。

图4 CAR-T细胞的原位PEG化可以消除神经毒性

【四嗪-反式环辛烯酸的原位PEG化反应】

为了探索这种原位PEG化策略是否可以推广到DBCO-叠氮化物以外的化学物质，接下来研究了使用四嗪（Tz）-反式环辛烯（TCO）反应来控制CAR-T细胞介导的CRS和神经毒性的能力（图5a-j）。将PEG600K、Tz-PEG1K、Tz-PEG600K或PBS静脉注射到老鼠体内，与输注PBS相比，Tz-PEG1K和未修饰的PEG600K治疗不影响肿瘤生长、体重减轻、高热和细胞因子释放（图5b-f）。Tz-PEG600K治疗极大地逆转了体重减轻、高烧和细胞因子的释放（图5c-f）。在PBS、PEG600K和tz-PEG1K处理组中，有高比例小鼠表现出神经毒性的迹象，而Tz-PEG600K治疗组的小鼠没有显示出这种神经毒性（图5g、h）。此外，Tz-PEG600K大大降低CRS的死亡率和致命的神经毒性（图5i、j）。

本研究发现CAR T细胞的原位PEG化（图6a-c）可以大大减少CAR T细胞、肿瘤细胞和单核细胞之间的相互作用，从而整体降低CAR T细胞的肿瘤细胞裂解和单核细胞过度活化（图6d）。随着时间的推移，CAR-T细胞缓慢扩张，PEG600K间隔层被稀释，逐渐恢复细胞间的相互作用（图6e、f）。CAR-T细胞-肿瘤细胞相互作用比CAR-T细胞-单核细胞相互作用更早恢复。通过这种方式，CAR-T细胞完全清除肿瘤细胞，但不会诱导过度的IL-6产生（图6g）。

图5 原位PEG化诱导的CRS和神经毒性缓解也可以通过四嗪（Tz）-TCO反应来实现

图6 原位PEG化策略调节细胞因子释放综合征和神经毒性的机制说明

【总结】

在现代药物发现领域，研究人员主要关注于开发基因、蛋白质、代谢或表观遗传水平调节细胞行为的治疗方法。本研究提供一个例子，疾病治疗可以通过调节细胞间与材料的相互作用来实现。本研究结果表明，CAR T细胞的原位PEG化对更安全的CAR T细胞治疗有很大的前景。由于PEG的使用可能会在体内诱导抗PEG抗体的产生，未来的工作将评估不同聚合物或纳米/微粒的原位偶联，作为控制CRS和神经毒性的替代“间隔物”。此外，由于细胞间的相互作用参与许多重要的生理和病理过程，未来的研究将探索使用原位生物材料偶联策略来治疗各种疾病。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41563-023-01646-6

来源：BioMed科技

转自：“高分子科学前沿”微信公众号

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