Cell | 分子量更小、效率更高的先导编辑器问世，效率可提高百倍！

先导编辑可以在活细胞中进行多种精确的基因组编辑。

2023 年 8 月 31 日，博德研究所刘如谦（David R. Liu）团队在 Cell 在线发表题为 Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors 的研究论文，该研究使用蛋白质进化和工程技术来生成体积更小、效率更高的先导编辑器。利用噬菌体辅助进化，该研究将紧凑型逆转录酶的编辑效率提高了 22 倍，并生成了比当前一代编辑器 PEmax 小 516-810 个碱基对的先导编辑器。

该研究发现不同的逆转录酶专门从事不同类型的编辑，并利用这一见解产生了优于 PEmax 和 PEmaxΔRNaseH(双 AAV 递送系统中使用的截断编辑器) 的逆转录酶。最后，该研究生成了改善先导编辑的 Cas9 结构域。这些编辑器 (PE6a-g) 增强了患者来源的成纤维细胞和原代人 T 细胞中与治疗相关的编辑。PE6 变体还可以在双 AAV 递送后在体内安装更长的插入，在小鼠大脑皮层中实现 40% 的 loxP 插入，与之前最先进的引物编辑器相比，提高了 24 倍。

先导编辑 (PE) 几乎可以在活细胞基因组中安装任何替代、小插入或小缺失，而不需要 DNA 或供体 DNA 模板中的双链断裂 (DSBs)，因此可以纠正绝大多数已知的致病突变。PE 需要一个先导编辑指导 RNA (pegRNA) 和一个先导编辑蛋白，该蛋白由一个可编程的缺口酶和一个逆转录酶 (RT) 组成。第一代先导编辑器 (PE1) 使用野生型 Moloney 小鼠白血病病毒 (M-MLV) RT，而随后的先导编辑器 (PE2-PE5) 使用工程五突变体 M-MLV RT。

pegRNA 包含一个向导 RNA 支架，一个指定目标位点的间隔物，一个与目标 DNA 互补的先导结合位点 (PBS)，以及一个编码所需编辑的逆转录酶模板 (RTT)。先导编辑器⋅pegRNA 复合体与目标基因组 DNA 的一条链配对，并切割另一条链，生成一个暴露的 3 ' 端，与 pegRNA 的 PBS 结合。RTT 与由此产生的引物-模板复合物结合，并启动 RTT 的逆转录。新合成的含有编辑的 3 ' DNA 瓣被整合到基因组中，取代原始的 DNA 序列并永久地安装所需的编辑。在 PE3 和 PE5 系统中，一个额外的单向导 RNA (sgRNA) 指导先导编辑器切断未编辑的 DNA 链，并偏向细胞错配修复，以有利于编辑器的安装。

自 PE 系统开发以来，通过设计 pegRNA、先导编辑器结构和细胞 DNA 修复反应来改善它们，以获得期望的结果。双先导编辑 (twinPE) 和相关的「双瓣」方法使用两个 pegRNA 编辑两条 DNA 链，从而实现更大的插入和删除 (>100 个碱基对 [bp])。PE 和 twinPE 已被用于安装重组酶着陆点，实现靶向基因大小 (> 5000 bp) 的插入和反转。

文章模式图（图源自 Cell）

尽管取得了这些进展，但事实证明，改进先导编辑蛋白具有挑战性。PE2-PE5 系统中使用的 M-MLV RT 突变是在数十年的改进 RT 筛选中确定的，随后进行了额外的筛选以优化哺乳动物的 PE 效率。这些突变对 PE 的效率至关重要，其他 RTs 中很少有类似的突变。使用紧凑 RT 的先导编辑蛋白可以促进体内先导编辑器的递送，不同的 RT 酶可能支持不同的编辑能力。然而，所有先前报道的使用 M-MLV RT 以外的 RT 的先导编辑器，即使经过大量的工程设计，也显示出比 PE2 低得多的 PE 效率。在 PE2 中进一步改进高度工程化的 M-MLV RT 也被证明是困难的，因为所有报道的这种 RT 的变体也对哺乳动物细胞 PE 产生了最小的改善。尽管报道了已知的改善核酸酶性能的 Cas9 突变也可以提高 PE 效率，但尚未报道特异性地鉴定出改善 PE 的 Cas9 突变。

该研究为 PE 开发了一种噬菌体辅助连续进化 (PACE) 选择，并使用进化和蛋白质工程来生成 PE6a-g 变体，这些变体比以前最先进的先导编辑器更有效和/或更容易在体内传递。PE6 变体与其他近期 PE 进展协同作用，在各种情况下提供累积益处，包括患者来源的成纤维细胞和原代人 T 细胞。双腺相关病毒 (Dual-AAV) 递送 PE6 系统的 PE 效率比之前最先进的系统提高了 12 至 183 倍，在小鼠大脑中安装 38 至 42 bp 的编辑，在小鼠皮质的转导细胞中产生 62% 的 loxP 序列靶向安装。

参考消息：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00854-1

图文来源：丁香学术公众号

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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