国自然热点：代谢-表观-转录，揭示肿瘤免疫逃逸机制

2022年3月22日，浙江大学医学院王青青教授、来利华副教授与浙大医学院附属二院丁克峰教授团队合作在Molecular Cell在线发表Lactylation-driven METTL3-mediated RNA m6A modification promotes immunosuppression of tumor-infiltrating myeloid cells研究论文，揭示肿瘤微环境中积累的乳酸，以蛋白乳酸化修饰（lactylation）的形式调控RNA甲基转移酶METTL3介导的肿瘤浸润髓系细胞（TIMs）的N6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰，促进TIMs的免疫抑制功能，介导肿瘤的免疫逃逸。

研究背景

肿瘤微环境（TME）是一个复杂的生态系统，显着影响肿瘤的免疫治疗效果。肿瘤浸润性髓系细胞（TIMs）通过聚集在肿瘤部位形成免疫抑制TME，帮助肿瘤免疫逃逸，并且其功能受到多种表观遗传机制的调控。其中，RNA的m⁶A修饰主要由甲基转移酶复合体（MTC）进行催化，MTC中METTL3是具有催化活性的关键蛋白，被证明具有促癌作用，但在调控TIMs功能中的作用仍不清晰。TME中乳酸积累是肿瘤的主要特征之一，研究证明，乳酸通过蛋白质乳酸化以及影响多种免疫细胞促进肿瘤的进展。

主要研究方法

（1）Co-IP

（2）m6A-RIP-PCR

（3）MeRIP-seq

（4）RNA-seq

（5）ChIP-qPCR

（6）RNA pull-down

研究结果

（1）首先分析TGCA数据库中RNA-seq数据后发现METTL3在多种类型的肿瘤组织中表达上调，并且其表达与免疫评分呈负相关；在结肠癌组织中METTL3的表达与T细胞耗竭标志基因的表达呈正相关，与髓系相关基因的表达也呈正相关。为了进一步确认METTL3在TIM中的作用，荧光抗体染色结果显示TIM中METTL3的平均荧光强度（MFI）比配对的正常邻近组织中的对照细胞显著升高。这些结果说明METTL3可能会促进免疫耗竭，因此下一步应该验证TIM中METTL3表达水平对免疫抑制的影响。

（2）根据qRT-PCR和WB检测结果发现当小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BM-MΦ）与与一些肿瘤共培养时，METTL3表达量显著增加；使用流式细胞术分离肿瘤小鼠模型的MDSC细胞与健康小鼠来源细胞比较，qPCR结果发现肿瘤小鼠来源的MDSC细胞中METTL3表达水平更高。流式检测CD45+CD11b+F4/80+Mɸ和CD45+CD11b+Gr-1+MDSC中METTL3表达水平，与无肿瘤小鼠相比METTL3表达水平上调。在确认m6A相关蛋白表达量发生变化后，第一反应是将METTL3敲低观察是否会有表型上的变化，于是构建了METTL3基因敲除小鼠模型（cKO），同时向WT和cKO小鼠皮下接种MC38结肠癌细胞，结果表明髓系细胞中METTL3的缺失显著减少了肿瘤的生长。STM2457是METTL3催化抑制剂，使用STM2457处理BM-MФ和MDSC细胞36h，然后将它们与MC38细胞（1：2）混合接种。结果显示STM2457治疗减缓了MC38肿瘤的生长。因此，METTL3可能具有针对TIM的免疫治疗的潜力，然而，使用METTL3抑制剂进行体内治疗是否能有效地抑制小鼠肿瘤的进展仍需进一步研究。

（3）为了确定METTL3的髓系缺陷是否重塑了肿瘤免疫微环境，检测了TIL的频率，与携带MC38的WT小鼠相比，cKO小鼠的CD4T+和CD8+T细胞群没有差异。PD-1和Tim-3是促进T细胞耐受的关键免疫检查点，携带MC38的cKO小鼠PD-1+Tim-3+耗竭CD8+T细胞的浸润减少，而cKO小鼠的CD4+CD25+ 调节T细胞（Treg）减少。在髓系方面，cKO小鼠CD45+CD11b+髓系细胞数量减少。METTL3在髓系细胞中的缺失导致CD206+M2样TAM的浸润率降低，而具有强大抗原呈递能力的CD103+cDC1的浸润率增加。缺失METTL3阻止（PMN）-MDSC在外周血、脾和肿瘤部位的聚集，并减少了M-MDSC在外周血中的渗透。CD14+Ly6G+PMN-MDSC在cKO小鼠肿瘤组织中的渗透较少，这些细胞被新定义为区别于TAN的关键免疫抑制细胞群。这些结果共同验证了髓系METTL3有效地驱动TIM在肿瘤部位的免疫抑制作用。

（4）缺失METTL3的MDSC的功能会有什么变化呢？进行了T细胞抑制实验。T细胞与cKO小鼠的MDSC共培养，经anti-CD3和anti-CD28刺激后，T细胞增殖受到的抑制较小，并产生较多的干扰素。为了探讨METTL3介导的促肿瘤作用的机制，对WT和cKO的BM-Mɸ进行RNA-seq，结果表明一些促肿瘤基因和免疫抑制基因在cKO BM-Mɸ中表达下调。此外，KEGG信号通路分析表明，髓系细胞中METTL3的缺失影响了JAK-STAT信号通路；GO分析表明，METTL3的缺失主要影响先天免疫反应和炎症相关基因。许多研究已经确定STAT3信号是TAM功能的关键调节因子。因此，为进一步了解METTL3介导的m6A修饰对JAK-STAT3通路的影响，先对实验样本中JAK1和STAT3蛋白水平进行检测，实验结果表明与WT小鼠细胞相比，cKO BM-Mɸ或MDSC的JAK1和STAT3磷酸化水平均减少，而对总STAT3或JAK2蛋白水平没有影响。利用FCM与qRT-PCR对BM-Mɸ或MDSC中JAK-STAT3通路下游的促肿瘤分子的变化进行研究，髓系细胞来源的一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）是T细胞抑制的关键免疫抑制效应因子，根据FCM结果显示缺失METTL3的TAM以及MDSC产生的ROS和NO水平明显降低。

（5）进一步探索METTL3-m6A修饰对JAK1转录本的影响。首先进行meRIP-seq，确认Jak1转录本上存在m6A修饰，而且具有RRACH的motif。为了阐明METTL3介导的m6A修饰在JAK1 mRNA代谢中的作用，通过qPCR结果说明METTL3不影响JAK1的转录水平。当细胞经蛋白酶体抑制剂处理后，JAK1在BM-Mɸ中积累，说明JAK1蛋白的降解主要依赖于蛋白酶体途径；但METTL3的缺失并不能逆转JAK1蛋白降解，这表明蛋白酶体途径不受METTL3的影响。无法直接建立联系时，又把目光聚焦在Reader蛋白身上。使用siRNA沉默YTHDF1的表达可以导致JAK1的蛋白水平降低。RIP-qPCR和链霉亲和素RNA-pull down实验表明，YTHDF1内源性和外源性均可增强BM-Mɸ中JAK1的表达。最后通过核糖体图谱从METTL3 WT和cKO BM-Mɸ中分离出不同的RNA组分：非翻译组分（<40S）、翻译起始组分（包括40S核糖体亚基、60S核糖体亚基、80S单体、<80S）和翻译活性多聚核糖体（>80S）。结果表明，cKO细胞中JAK1 mRNA在多聚核糖体中的数量明显低于WT细胞（下图J）。

（6）根据之前的相关研究发现在肿瘤微环境中乳酸积累是各种类型癌症的共同特征，因此检测了BM-Mɸ-MC38共培养培养基或MC38肿瘤组织中乳酸的实际浓度，在共培养培养基和MC38组织中都检测到较多的乳酸积累。在BM-Mɸ和BM-MDSCs的培养基中加入25mM乳酸后，METTL3的表达显著上调。考虑到需要在表观层面影响METTL3的表达水平，那么组蛋白修饰是个很好的切入对象。BM-Mɸ-MC38共培养表现出H3K18la修饰水平升高；通过H3K18la抗体进行ChIP-qPCR，结果说明H3K18la富集在METTL3基因座的启动子区。这些结果表明，TME中积累的乳酸足以通过提升H3K18la修饰水平来激活METTL3的表达。

（7）在探究乳酸修饰对METTL3功能影响的过程中发现，METTL3的乳酸修饰位点包括K281和K345，并且细胞中的METTL3乳酸化不会影响RNA甲基化酶复合物的结合、METTL3的核定位功能、自身稳定性及其泛素化作用。在TIMs中，METTL3的酶活性受乳酸化修饰而增强。而METTL3的K281R、K345的突变会减弱RNA的甲基化修饰，并且促肿瘤基因的表达水平也下降。由此证明，乳酸化修饰发生在METTL3的ZFD区域，并且其乳酸化能促进RNA的m6A修饰。

总结

本研究从“代谢-表观-转录”层面，揭示肿瘤微环境持续积累的乳酸如何促进METTL3表达和功能，继而以m6A修饰方式增强JAK1-STAT3枢纽信号活化，结果可能为靶向髓系细胞的肿瘤免疫治疗策略提供新的启示。另外，组蛋白乳酸化修饰是近几年来新发现的修饰，与研究的较多的传统组蛋白修饰（H3K27ac/H3K4me3等）相比，创新性较强，因此也是目前的热点研究。

转自：“朗盟医学”微信公众号

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