自组装，Nature Nanotechnology！

▲第一作者：Y.-H. Peng

通讯作者：E. Krieg

通讯单位： 德国莱布尼茨高分子研究所，德国德累斯顿工业大学

DOI：

https://doi.org/10.1038/s41565-023-01483-3

01

研究背景

超分子水凝胶是通过非共价键连接的分子三维(3D)网络。它们的动态特性赋予了它们独特的性质，如刺激响应性和自我修复。含有自组装DNA的水凝胶特别有趣，因为DNA的序列选择性识别使复杂的可重构材料能够模块化构建。利用DNA纳米技术的原理，这些系统的性质可以在情境中编程和动态改变。在它们的应用中，基于DNA的水凝胶可以支持3D细胞培养，例如，研究发育生物学的机制，重述病理学和开发(个性化)疗法。3D细胞和器官培养依赖于粘弹性基质的机械支持。然而，常用的基质材料缺乏对关键细胞指导特性的控制。

02

研究问题

本研究报道了基于DNA库的全合成水凝胶，它与超高相对分子质量的聚合物自组装，形成动态DNA交联基质(DyNAtrix)。DyNAtrix通过改变DNA序列信息，使其能够通过计算预测和系统地控制其粘弹性、热力学和动力学参数。可调节的热激活性质允许哺乳动物细胞均匀嵌入。有趣的是，应力松弛时间可以在四个数量级上调整，这大大增强了活体组织的力学性能。DyNAtrix具有自我修复、可打印、高度稳定、细胞和血液相容性好、降解可控等特点。基于DyNAtrix的人骨髓间充质干细胞、多能干细胞、犬肾囊肿和人滋养层器官样细胞的培养显示出高活性、高增殖和高形态发生。DyNAtrix因此为生物力学、生物物理学和组织工程的先进方法提供了一个可编程和多功能的精度矩阵。

▲图1|DyNAtrix的基本概念和交联剂设计

要点：

1.本研究首先合成了三个衍生物P1、P5和P10，每个骨架的平均共价连接DNA链分别为3、20和28条(图1a)。DNA链作为基于DNA的交联剂模块的非共价连接的通用锚点。因此，单一的聚合物批次可以用来组装具有极大不同性质的材料。在细胞培养研究中，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序的合成肽被连接到骨架上，以促进细胞黏附和机械信号传递。RGD接枝的衍生物PRGD5和PRGD10与无肽的衍生物具有相似的分子量。

2.令人惊讶的是，最初试图用简单的夹板链在低浓度下能够交联成聚合物，但未能产生稳定的凝胶。由于凝胶硬度与有效交联键的数量成正比，本研究假设无效的分子内键主导于形成网络的分子间交联键(图1b)。分子内键不是DNA凝胶所特有的，而是聚合物凝胶中的一种普遍现象，通常会使交联率降低到20%或更低。

3. DNA杂交的序列选择性为这个问题提供了一个独特的解决方案：本研究不再使用单一夹板类型，而是基于双夹板设计构建了复杂的库(图1c，d)。所有对象都包含一个相同的适配域，该适配域在特定熔融温度T1以下结合锚链。此外，每个夹板包含一个重叠结构域，该结构域仅与低于第二熔化温度T2的另一个夹板配对。适配器和重叠结构域被设计为具有充分分离的熔化温度，从而确保在一锅退火工艺中从95 ℃冷却到20 ℃时连续结合。

▲图2|CCL交联DyNatrix的理论预测和流变学验证

要点：

1.统计模拟说明了CCL的复杂性和每个聚合物的锚链数量如何影响交联效率(图2a)。为了抑制80%的分子内交联链，预测P1、P5和P10分别需要4、40和60对夹板。本研究首先用包含1、4、16、64或256对夹板(CCL-1至CCL-256)的CCL库去补充P5。在广泛的频率和应变范围内，弹性模量(G’)大大超过损失模量(G”)，证实双夹板CCLS与UHMW聚合物结合可产生稳定的凝胶。增加CCL复杂性逐渐将交联率从28%(CCL-1)提高到76%(CCL-64)，但不会进一步增加超过CCL-64库的大小(图2c)，这与预测(图2a)非常一致。

2.与之前报道的具有良好流变性的合成DNA凝胶相比，UHMW聚合物骨架的高交联率使其能够形成DNA含量极低的稳定凝胶(图2d)。Ccl-64交联的P1和P5的临界凝胶浓度为~0.2%(w/v)，对应的DNA含量分别为0.05 g L−1和0.26 g L−1。

▲图3|DyNAtrix的热可逆性、自愈性、生物印迹和可调应力松弛

要点：

1.正如预期的那样，DyNAtrix经历了热可逆的溶胶-凝胶转变(图3a)。其熔点随着CCl复杂性的增加而降低，从65℃(CCl-1)到53℃(CCl-256)，因为每对不同夹板的浓度随着库的复杂性的增加而降低。本研究观察到的基质熔化位移与重叠序列的最近邻热力学预测非常一致。

2. DyNAtrix键的明确可逆性也有助于生物打印。挤压生物打印机通常需要具有自我修复功能的水凝胶，这种凝胶可以在机械压力下液化，作为流体通过打印机喷嘴，同时保护细胞免受破坏力的破坏，并在挤压后迅速凝固。为了测试印刷适性，本研究通过振荡流变学进行了自我修复实验：当受到大变形时，超分子网络破裂，但一旦应力降低，就会迅速恢复(图3b)。

3.在连续10个断裂愈合周期中，DyNAtrix恢复了95%的硬度，表明可逆交联物作为预定义的机械断裂点。由于DyNAtrix具有自我修复功能，因此很容易通过一个细喷嘴挤出和打印(图3c，d)。打印后的包埋细胞显示出较高的活性和增殖能力，说明DyNAtrix适合自上而下构建活体组织支架。

▲图4|HAC使DyNAtrix能够在细胞兼容的条件下进行受控凝胶

要点：

1.下一个目标是使DyNAtrix与标准细胞封装工艺兼容。在经典的3D培养中，细胞分散在前体溶液中，随后开始凝胶化。例如，将Matrigel溶液和细胞在4℃混合，然后加热到37 ℃，这将在哺乳动物细胞培养的理想温度下触发凝胶。相比之下，液化DNA交联凝胶通常需要超过交联剂熔化温度，这将对细胞造成损害。本研究最初试图通过快速混合两个预退火的前体溶液来封装细胞来克服这个问题(图4b左)。然而，快速的结合动力学导致在混合完成之前快速形成交联剂，从而产生硬度不足的不均匀基质(图4c和图4d左侧)。

2.作为解决方案，本研究通过使用封闭链升级CCL设计来设计热激活交联剂(HAC)(图4a)。阻断链作为保护基团，防止在低温下过早重叠结构域结合。因此，两种聚合物前驱体溶液的混合物在4 ℃时处于亚稳液体状态，从而细胞和介质的混合可以继续进行到完成。封闭链被设计成在37 ℃时自发从重叠结构域解离，从而激活交联剂。根据这一设计，加热到37 ℃导致快速形成具有优异硬度(图4c)的均匀凝胶(图4d)。随后，本研究在所有的细胞培养实验中使用了HAC。

▲图5|DyNAtrix在细胞培养中对降解具有可调的稳定性，高度的生物相容性和DNA酶 I介导的活细胞释放

要点：

1.基于DNA的凝胶很容易被脱氧核糖核酸酶 I消化，脱氧核糖核酸酶I是一种核酸酶，通常存在于含血清的介质中。本研究的目标是保护DyNAtrix，同时保留在需要时进行受控酶修饰的选项。本研究首先测试了DyNAtrix在添加胎牛血清的培养液中的稳定性，发现在48 h内确实发生了实质性的降解。然后测试了肌动蛋白的效果，它是已知的能够抑制DNase I的蛋白。使用荧光标记的DNA模拟靶点，本研究表明肌动蛋白可以用来调节DNA酶 I的消化速度(图5a)。50 µg ml−1的浓度足以抑制凝胶降解48 小时(图5b)，在80 µg ml−1情况下提供几乎完全的DNA酶 I抑制，并且在细胞培养实验中保留DyNAtrix至少2 周。添加柠檬酸盐也能达到同样有效的保护效果。然而，由于柠檬酸盐对钙离子的螯合被怀疑会影响细胞发育，本研究选择了肌动蛋白作为默认保护策略。

2.为了检测细胞相容性，本研究在肌动蛋白保护的DyNAtrix中培养人间充质基质细胞(MSCs)。骨髓间充质干细胞在7 天内表现出极好的存活率(91-99%)，发现其显著高于二维培养皿，甚至在大多数实验中表现优于Matrigel(图5c)。随后重组DNA酶 I的加入淹没了肌动蛋白的保护，允许逐渐的基质解构和按需释放活细胞(图5e)。

▲图6|DyNAtrix与各种3D细胞和有机培养物兼容

要点：

1.为了验证高级细胞培养和类器官研究的适用性，本研究在DyNAtrix中嵌入了另外三种细胞类型：(1)人诱导多能干细胞(HiPSCs)，它为细胞水平的疾病体外建模提供了患者特有的平台(图6a，d，e)；(2)Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞，这是一个发育上皮组织的模型系统(图6b)；(3)人滋养层干细胞(HTSCs)，它可以发育成滋养层器官类化合物，从而可以在体外对胎盘发育和妊娠相关疾病进行研究(图6c，f，g)。

2.本研究评估了细胞的活力、增殖和自组织，并测试了黏附部位([+RGd]和[−RGd])对它们的发育和形态发生的影响。在化学定义的无血清培养液中培养HiPSCs。值得注意的是，DyNAtrix在整个培养期间(7 天)保持完好，即使没有肌动蛋白补充。在无血清MDCK和滋养层细胞培养中也得到了类似的结果(图6b，c)，这表明核酸酶的主要来源是补充血清，而不是由嵌入细胞的分泌的。

3. DyNAtrix和Matrigel中的HiPSC活性在统计学上是不可区分的。在培养1 周期间，hPSCs持续增殖，形成圆形的中空囊泡，并继续扩张(图6d)。囊的大小、形态和数量似乎与Matrigel参考培养中形成的相同。共聚焦显微镜显示，包囊强烈表达多能标记OCT4，进一步证明该材料是有效的支持性材料(图6e)。

03

结语

总而言之，DyNAtrix提供了一种混合匹配的矩阵工程方法。具有不同性质的DNA模块和聚合物骨架可以以不同的组合展开。例如，HAC交联的DyNAtrix可以进一步升级为带有荧光DNA应激传感器，以揭示细胞与环境的机械相互作用。DNA适配子可以被整合来清除(或逐渐释放)特定的生物分子。这样的模块可以按需激活(例如，通过温度)、修饰(例如，通过杂交)以及随后从聚合物支架上释放(例如，通过限制性内切酶)。本实验室目前正在研究应力松弛时间对各种细胞和类器官模型发育的影响。在未来，DyNAtrix可以由分子逻辑门和基于DNA链置换级联的合成调节电路自主控制。因此，本研究设想这类可编程材料将为3D细胞和有机物培养以及其他一系列生物医学应用创造前所未有的选择。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41565-023-01483-3

转自：“研之成理”微信公众号

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