NBE | 北京大学赵美萍等团队合作开发新的方法，来检测临床样本中的低频突变

DNA富集技术的效率往往不足以检测发生在低频率的突变。

2023年7月27日，北京大学赵美萍、华中科技大学吴曈勃及肖先金共同通讯在Nature Biomedical Engineering（IF=28）在线发表题为“Detection of low-frequency mutations in clinical samples by increasing mutation abundance via the excision of wild-type sequences”的研究论文，该研究报告了一种DNA切除方法，用于在单核苷酸分辨率下检测基因组DNA和循环无细胞DNA中的低频突变。该方法基于一种竞争性的DNA结合和消化机制，由单链磷酸化DNA (sgDNase)引导的脱氧核糖核酸酶I (DNase)作用，用于去除野生型DNA链。

sgDNase可以针对任何野生型DNA序列设计，允许在温和温度条件下在单链磷酸化DNA的靶结合区域内均匀富集所有突变。sgDNase预处理使所有突变链的初始频率低至0.01%，并导致对多序列背景下所有类型的单核苷酸错配的高辨别因子，正如在癌症患者血液或组织样本中鉴定低丰度突变所示。该方法可与下一代测序、液滴数字聚合酶链反应、Sanger测序、荧光探针检测等多种突变检测方法相结合。

癌症的分子诊断强调了驱动基因改变在肿瘤生长和转移中的作用。液体活检能够检测和量化血液样本中循环无细胞DNA (cfDNA)的基因组变化，与传统的组织活检相比，它具有明显的优势，因为它方便、侵入性小、对早期肿瘤的敏感性高。尽管遗传变异的痕迹可能为癌症患者提供丰富的诊断或治疗线索，cfDNA中的突变通常处于非常低的水平，这对现有方法来说仍然是一个巨大的挑战。

使用普通TaqMan探针的液滴数字PCR (ddPCR)可以定量检测到丰度>0.1%的突变。高灵敏度的多重ddPCR需要最大限度地增加区室数量，并使用昂贵的Minor Groove Binder (MGB)或Locked Nucleic Acid (LNA)修饰的TaqMan探针。由于测序深度高，下一代测序(NGS)可以检测到丰度低至10−7的突变。然而，灵敏度受到四个分离和连接步骤的低转化率的限制。这些方法的临床应用进一步受到探针设计复杂、温度稳健性强、辅助仪器/试剂昂贵以及易出现假阳性结果等因素的限制。

对低水平改变DNA进行敏感检测的一个主要挑战是来自大量过量野生型(WT) DNA链的强烈背景噪声。为了解决这一问题，选择性PCRs如COLD-PCR、和阻滞剂PCR被开发出来，以比WT DNA更有效地扩增突变型(MT) DNA。然而，随着初始突变丰度的降低，富集效率明显下降。由于WT DNA提供的临床信息很少，在突变检测之前消除这些背景序列是另一种提高MT DNA敏感性的有趣方法。为此，开发了一种基于双工特异性核酸酶(DSN)的方法(NaME-PrO测定)，使用重叠寡核苷酸(探针)去除WT DNA。该方法能够在扩增前在基因组DNA (gDNA)水平上对WT DNA进行多重降解。然而，它依赖于相对严格的温度控制，以避免MT DNA的消化。DASH检测基于CRISPR/Cas9也被用于去除测序文库和分子计数应用中不需要的物种。

通过竞争性结合和消化机制说明sgDNase系统（图源自Nature Biomedical Engineering ）

然而，DASH需要一个PAM位点(NGG)在靶区，这对不同的突变DNA序列缺乏普遍适用性。最近，分别利用来自嗜热热球菌(TtAgo)和炽热焦球菌(PfAgo)的Argonaute开发了NAVIGATER和A-STAR，可以选择性地去除不需要的WT序列，而不需要PAM位点。然而，为了在NAVIGATER中实现高富集效率，切割步骤需要与PCR程序分开进行(>80°C 1小时)，这既耗时又增加了产生链断裂的潜在风险。相比之下，A-STAR可以在单一反应中结合WT DNA去除和PCR，尽管必须进行扩增前步骤，并且该分析依赖于在引导链上人工引入的突变来区分指定的突变。

该研究开发了一种独特的DNA切除工具，通过竞争性的结合和消化机制来指导DNA酶与sspDNA (sgDNase)的特异性，该工具在不破坏单碱基不同MT链的情况下精确去除WT序列。该研究系统地检测了sgDNase的一般适用性和高富集效率，证明了gDNA的直接预处理和使用适当的sspDNA链组合的多路预处理都是有效的。该方法在活检样本中发现了几个初始丰度~0.01%甚至更低的阳性突变，这些突变是NGS或全外显子组测序(WES)无法检测到的。sgDNase具有单核苷酸分辨率和对所有序列的普遍适用性，可用于各种癌症和相关疾病的诊断和治疗。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-023-01072-8

转自：“iNature”微信公众号

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