BB.滚环转录扩增导向的串联菠菜荧光发光生物传感器的构建及其对β-葡萄糖基转移酶活性的无标记检测

以下文章来源于分析化学方法 ，作者科研小组

全文简介

β-葡萄糖基转移酶(β-GT)能特异性催化5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)转化为5-葡萄糖基羟甲基胞嘧啶(5-ghmC)，并通过影响体内和体外转录过程控制噬菌体特异性基因表达。目前用于β-GT测定的策略通常涉及昂贵的设备、费力的处理、放射性危害和较差的灵敏度。在这里，我们报道了一种基于菠菜的荧光发光生物传感器，通过利用5-hmC糖基化起始的滚环转录扩增(RCTA ),用于β-GT活性的无标记测量。我们设计了一种5-hmC修饰的多功能环形检测探针(5-hmC-MCDP ),它在一个探针中集成了靶识别、信号转导和转录扩增的功能。β-GT的引入催化5-hmC-MCDP探针的5-hmC糖基化，保护糖基化的5-mC-MCDP探针不被MspI切割。剩余的5-hmC-MCDP探针可以在T7 RNA聚合酶的帮助下启动RCTA反应，产生串联菠菜RNA适体。串联菠菜RNA适体可以被荧光团3，5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮照亮，便于β-GT活性的无标记测量。值得注意的是，MspI催化的非糖基化探针的高特异性切割可以有效地抑制非特异性扩增，使该测定具有低背景。由于RCTA比规范启动子启动的RNA合成具有更高的效率，RCTA的信噪比比基于线性模板的转录扩增高4.6倍。该方法能够灵敏地检测β-GT活性，检测下限为2.03 × 10-5 U/mL，可用于抑制剂的筛选和动力学参数的测定，在表观遗传学研究和药物发现方面具有巨大的潜力。

简介

（A）T4 β-GT催化葡萄糖基化反应期间分子结构变化示意图。（B）5hmC的葡萄糖基化通过MspI酶保护DNA底物的分裂。（C）基于菠菜的荧光生物传感器的示意图，用于无标签和敏感的β-GT活性测量。

（A）β-GT分析的RCTA策略示意图。（B）用MspI限制酶对5-hmC-MCDP探针的解理进行非denaturing PAGE分析。车道1，25 nM 5-hmC-MCDP +100 U/mL β-GT + 5 U of MspI；车道2，25 nM 5-hmC-MCDP +5 U of MspI；车道M，20 bp标记。（C）DFHBI荧光信号作为5-hmC-MCDP浓度从1到35 nM的函数。（D）用（红线）和无（控制，黑线）β-GT测量荧光光谱。插图显示（红线）和无（控制，黑线）β-GT的DFHBI荧光信号。

（A）由RCTA策略诱导的荧光发射光谱，以响应各种浓度β-GT。（B）DFHBI荧光信号与对数尺度中β-GT浓度的线性图。

（A）通过RCTA策略测量荧光强度，以响应100 U/mL UDG，100 U/mL HhaI，100 U/mL Dam，1 mg/mL BSA，100 U/mL β-GT，以及仅含缓冲液的阴性对照。（B）各种浓度β-GT分别在大坝和HhaI存在下产生的荧光信号。（C）5-C、5-mC、5-hmC和5-ghmC的结构。（D）响应25 nM C-MCDP、25 nM 5-mC-MCDP、25 nM 5-hmC-MCDP和无MCDP的对照组的荧光强度。

（A）5′-UDP-Na2对β-GT活性的抑制作用。插图表示5′-UDP-Na2的结构。（B）4-苯基咪唑对β-GT活性的抑制作用。Inset展示了4-苯基咪唑的结构。（C）各种浓度UDP-Glc的初始速度变化。（D）不同浓度5-hmC-MCDP的初始速度变化。

（A）对照组分别没有β-GT（灰色柱）、1%胎儿牛血清（粉红色柱）、100 U/mL β-GT（青色柱）和100 U/mL β-GT + 1%胎儿牛血清（红色柱）产生的荧光强度。（B）1%胎牛血清中实际输入与测量的β-GT浓度之间的相关性。（C）对照组分别不含β-GT（黑柱）、HeLa细胞提取物（橙色柱）、100 U/mL β-GT（绿柱）和100 U/mL β-GT + HeLa细胞提取物（蓝柱）的荧光强度。（D）HeLa细胞提取物中实际输入与测量的β-GT浓度之间的相关性。（E）质粒转染和β-GT检测的示意图。（F）测量响应细胞内β-GT活性的荧光强度。

相关成果以“Rolling circle transcription amplification-directed construction of tandem spinach-based fluorescent light-up biosensor for label-free sensing of β-glucosyltransferase activity”，发表在国际学术期刊“Biosensors and Bioelectronics”上。

转自：“NANO学术”微信公众号

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