干货|免疫细胞化学（ICC）实验步骤及疑难问题

免疫细胞化学 (ICC) 是一种使用荧光抗体或染料来检测细胞内靶抗原的技术。

本文将带您了解ICC 的实验流程以及ICC 实验常见疑问的解答。

01. ICC实验步骤

ICC 实验流程通常包括细胞培养与固定、通透处理、封闭、一抗孵育、二抗孵育和封片观察 6 个部分。

图1：ICC实验流程概览

1.1

细胞培养/固定

很多抗原在离体组织中只存在很短时间，自溶和坏死使得抗原进一步降解，组织形态和结构被破坏。样品浸泡在合适的固定液中，固定液完全渗透组织，使蛋白失去活性，并且使组织被「保存」、稳定在接近 in vivo 状态。

细胞培养是 ICC 实验的基础，细胞状态直接影响 ICC 实验结果。不管是悬浮细胞还是贴壁细胞，进行 ICC 实验时都需要确认以下注意事项：

细胞状态是否正常：形态，密度等

有些抗原需要药物或胁迫刺激才表达

细胞传代次数过多导致特征发生变化

细胞爬片是否使用如 Poly-lysine 等进行包被处理，使细胞更易于吸附在爬片上

细胞固定所使用的固定剂也分为交联试剂和有机溶剂两类：

01. 交联试剂有利于保护细胞结构，但是会产生蛋白交联，可能会降低抗原性

02. 预冷的有机溶剂固定会吸去脂类使细胞脱水、蛋白变性，通常不需要对细胞进行额外的通透处理。

对于定位不同的抗原需采用不同的固定方案：

01. 对于细胞核抗原，可以尝试对细胞使用 4% PFA 室温固定 10-20min。

02. 对于细胞浆抗原，可以尝试对细胞使用 -20℃ 预冷甲醇 -20℃ 固定 5-10min。

对于不同的靶标蛋白，选择合适的固定剂非常重要，如图，ITAM 是一个定位于细胞膜上的靶标蛋白，使用无水甲醇对细胞样本进行固定，则可以很好的观察到 ITAM 的表达，而使用 4% PFA 进行固定则会得到错误的定位结果。

图2：不同固定剂对 ITAM 蛋白定位的检测

那么该如何挑选合适的固定剂呢？且往下看：

可溶性溶剂比如丙酮、乙醇等能去除脂类物质并使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。交联剂比如多聚甲醛可以通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。

组织或细胞经过固定后可使胞内蛋白凝固，减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；保持组织或细胞的抗原性，避免抗原发生弥散；保持组织和细胞的固有形态和结构。

不同类型固定剂优缺点如下：

这份【不同细胞器首选固定剂方法】，供大家参考：

当然，固定剂的选择其实是没有通用规则的，以上表格也是经验之谈，不排除有特殊情况。如果没有达到预期的实验效果，您也可以尝试更换其他固定试剂。

1.2

通透处理

通透即为对细胞膜进行打孔处理，使抗体能进入到细胞中和抗原发生结合。

图3：细胞膜打孔处理示意图

通常，当抗体检测细胞内蛋白时（包括抗原表位在胞内段的跨膜蛋白），需要对细胞进行通透，一般将细胞样品在含 0.1-0.25% Triton X-100 的 PBS 中孵育 5-10 分钟。

如使用有机溶剂固定则不需要额外进行通透处理。

特别建议：

用丙酮、乙醇或甲醛（高浓度）固定细胞骨架、病毒和一些酶抗原，可获得理想的结果。

位于细胞器和胞浆颗粒上的抗原，其固定和通透方法的选择取决于抗原本身，需尽量保留表位。

1.3

封闭

对样本进行封闭，同样是为了阻断抗体抗原之间的非特异结合，降低背景和潜在假阳性染色。

特别建议：

如使用荧光标记物进行后续实验, 当使用甲醛固定时，在封闭液中加入0.3M 甘氨酸，淬灭醛基引起的自发荧光，这样得到的结果更优质。

1.4

一抗孵育

ICC 实验的成功也依赖于靶标抗原特异性结合的一抗。

1.4.1 选择一抗

需要考虑的要点

产生一抗的来源种属与要检测的种属不同

一抗是否能与目标蛋白结合？

是否曾证实一抗在您的应用中有效？

1.4.2 抗体特异性

抗体特异性最确凿的证明是，在目标蛋白已被敲除的组织或细胞中缺乏染色。

其他指标有

信噪比：抗体可能结合正确的蛋白质，但也会有一定的噪音，因此应拒绝信噪比低的抗体

如果无法进行 KO 验证，并且您仅确定定位特异性，则信噪比尤其重要

染色模式与目标蛋白在对照细胞或组织中的已知定位一致

已知不表达该蛋白质的组织或细胞缺乏染色

免疫印迹中仅看到单一条带

图4：野生型（上图）和敲除 HAP1 细胞（下图）中 Ki67 抗体敲除试验的 ICC 图像。

绿色代表���抗 - Ki67  、山羊抗兔 IgG  ，红色代表���抗 α-微管蛋白 ,蓝色代表��� DAPI 标记的核 DNA。

1.4.3抗体浓度

确定最佳或最优的抗体工作浓度，可以使特异性染色最大化并减少背景。不熟悉抗体稀释度的小伙伴也可以根据相应产品说明书推荐的起始浓度进行尝试。

【使用何种稀释度：

抗体和抗原之间的结合率、亲和常数可受温度、pH 和缓冲液成分的影响。改变溶液中抗体和抗原的相对浓度也可控制抗体-抗原复合物的形成程度。由于我们通常无法改变抗原的浓度，因此必须针对每种应用和每组实验条件，通过稀释来确定每种抗体的最佳工作浓度。

优化抗体稀释度：滴定实验

可实现最佳染色效果和最低背景信号的最优抗体浓度必须在每次分析中通过实验方法单独确定，常用的方法是涉及一系列稀释度的滴定实验。例如，如果产品数据表推荐的稀释度为 1:200，我们建议您采用 1:50、1:100、1:200、1:400 和 1:500 的系列稀释度来确定最佳浓度。

进行滴定实验时，首先应选择固定的孵育时间，然后再制备一系列实验稀释度的抗体。每个稀释度都应采用相同类型的样品进行测试，以保持相同的实验条件。

许多抗体都具有良好的批次间一致性，因此大部分情况下只需进行一次滴定实验。然而，特别是对于多克隆抗体而言，如果同种抗体不同批次的染色结果发生了变化，我们建议您再次进行滴定实验。】

同时也建议在进行新的 ICC 实验时，使用新鲜抗体，避免重复利用。

1.5

二抗孵育

对于间接检测，二抗是成功显示一抗分布的关键。使用二抗和相关检测系统能够扩增信号，因为不止一个二抗分子与单个一抗结合。

化学显色与荧光检测：您可以选择化学显色法，使用酶标记的二抗，也可以选择荧光法（免疫荧光），使用荧光染料标记的二抗进行检测。

1.5.1 荧光法

对于绝大多数实验者来说，荧光二抗一定是他们的第一选择，所以对于带有荧光基团的二抗，提醒：

一定要注意避光保存！

确定合适的二抗工作浓度浓度，避免无信号或背景过高现象的发生。

多蛋白检测时，选择偶联不同荧光基团的二抗，避免串色现象发生。

那抗体该如何保存呢？

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1.通用保存指南

收到抗体后，您需要以 10,000 x g 的离心力离心 20 秒，排出卡在小瓶螺纹里的溶液，然后分装至低蛋白结合微量离心管中。分装可以最大限度地减少因反复冻融导致的损失，因为反复冻融会使抗体变性，导致抗体形成聚合物，从而降低抗体的结合能力。分装还可以最大限度地减少因多次从一个小瓶中移液引发的污染。

分装抗体应冻融一次，如有剩余，在 4°C 下保存。通常建议在 -20°C 下保存抗体，因为在 -80°C 下保存抗体的优势并不明显。但是，由于抗体存在形式差异，保存温度可能有所不同，因此请务必查看官网说明书，获取具体的温度建议。

分装量的多少取决于您每次实验的常规用量。分装量不得少于 10 μL。分装量越少，储备液浓度就越容易受到蒸发以及抗体吸附在存放瓶表面的影响。

大多数情况下，收到抗体后，可在 4°C 下保存一至两周。因此，遵循官网说明书上的建议至关重要。

2.避免冻融损失

避免使用无霜冰箱：虽然您的实验室不太可能会反复冻融，但还是提醒您避免反复冻融。因此，抗体瓶应放置于冰箱中温度变化最小的区域，例如冰箱后壁处，而非冰箱门处。

一些研究人员为了防止反复冻融造成的损失，会在抗体中添加冷冻保护剂甘油至抗体终浓度为 50%，因为甘油可以将冰点降低至 -20°C 以下。虽然对许多抗体来说，这种做法是可行的，但您仍应查阅官网说明书，以确定制造商是否对抗体在这种保存条件下的稳定性进行了测试。

由于 -80°C 低于甘油的冰点，所以不建议在 -80°C 下保存添加甘油的溶液。此外，甘油或其他冷冻保护剂可能会被细菌污染，因此，您必须获得无菌溶液。

3.偶联抗体的保存

由于偶联抗体比未偶联抗体更加复杂，所以保存和操作偶联抗体期间需要注意的事项更多。例如，偶联抗体，无论是荧光染料偶联抗体、酶偶联抗体还是生物素偶联抗体，当暴露于光照时都会影响偶联抗体的活性，所以需要保存在深色瓶内，或者包裹上铝箔。荧光偶联抗体特别容易受到光淬灭的影响，因此在整个实验过程中均应避光操作。

下表提供了妥善保存和处理偶联抗体的详细指南。

待分析物

荧光标记物，如 Alexa Fluor®、Dylight®、FITC、PE

酶偶联抗体，如 HRP

处理

收到产品后立即分装

避免反复冻融

存放在深色或防紫外线的容器中

分装

分装时避免光线直射

收到抗体后，以 10,000 x g 的离心力离心 20 秒

分装前用移液枪轻柔混匀。重复 3 - 4 次。请勿翻转混合，避免溶液起泡

请勿在 HRP 偶联抗体中加入叠氮化钠，因为这种保护剂会抑制 HRP 的活性

长期存放

遵循制造商官网说明书上的建议

如果含有冷冻保护剂（例如甘油）*，则在 -20°C 下保存

保存在深色小瓶或用锡箔纸包裹的试管内

短期保存

+4°C 下短期保存（1 - 2 周）

4.使用叠氮化钠防止污染

为防止微生物污染，您可以在抗体溶液中添加叠氮化钠，至终浓度为 0.02%（质量浓度）。如果抗体已经包含该保护剂，将在官网说明书的储存缓冲液部分指明。

什么时候不能使用叠氮化纳

利用抗体染色或处理活细胞时，或者开展 in vivo 研究时，应避免使用叠氮化钠。这种抗菌剂会阻断细胞色素的电子传递系统，因此对大部分生物体都有毒性。

叠氮化钠会干扰胺基的偶联，因此应在偶联之前需将其去除。偶联后，您可以将抗体存放在叠氮化钠中，但 HRP 偶联抗体除外，因为叠氮化钠会抑制 HRP。  叠氮化钠可以用 0.01% 的硫柳汞（merthiolate）代替，后者不含伯胺。此外，还可以使用透析、超滤或凝胶过滤法去除抗体溶液中的叠氮化钠。

5.蛋白质的浓度和稳定性

通常来说，蛋白质在较高浓度下保存时不易发生降解，理想浓度为 ≥1 mg/mL。因此，稀释至工作浓度的抗体在 4°C 下保存时，最好不要超过一天时间。

如果抗体浓度很低，可以在抗体溶液中添加蛋白稳定剂，如 BSA。蛋白稳定剂可吸附于管壁，将抗体损失降至最低。但是，由于蛋白稳定剂会与抗体竞争，降低结合效率，所以请勿在您打算偶联的抗体中添加蛋白稳定剂。

1.5.2 酶显色法

生物素标记的二抗和链霉亲和素-HRP 能进一步扩增信号。或者，您也可以使用现代 HRP-聚合物二抗。

一些沉淀物具有光稳定性（HRP/DAB 具有很好的光稳定性，但 HRP/AEC 在阳光下会褪色），所以载玻片有可能储存多年。

仅需要标准的明场显微镜。

酶/显色剂沉淀物的沉积区域比来自荧光源的光子沉积区域更宽，这可能影响个人解读结果的能力。

该过程通常耗时较长，因为它的孵育和封闭步骤比荧光方法要多 — 但是，情况并非总是如此，具体取决于您使用哪种扩增系统。

由于酶的扩增作用，定量一般比较困难。

1.6

封片观察

显色完成后，通常会对细胞进行复染，复染剂对特定的细胞结构进行染色，增加染色对比效果，明确细胞或亚细胞定位。

复染试剂的选择取决于您对样品的染色方式：显色剂（一种在标准光学显微镜下可见的染料）或荧光染色。

1.6.1显色型核复染试剂

在酶检测体系中，最常见的核复染剂是苏木精。苏木精是一种从木材中提取的蓝紫色显色剂，可以对核酸染色，不能对蛋白质染色。苏木精的蓝色与DAB（棕色/黑色）、AEC（粉色/红色）和固红（粉色/红色）等常用的显色剂可以形成很好的对比。但它不适用于荧光检测。

1.6.2 荧光染色

复染完成后，在切片上滴加中性树脂或直接使用含 DAPI 的防荧光淬灭封片剂，在切片上盖上玻片来保护和保存切片。

封片剂的优点在于维持细胞样品状态，防止样品变干，同时可以防止荧光淬灭，提高折射率（Refractive Index），提高图像的分辨率，以获得高质量的 ICC 实验结果。

图6：含DAPI的防荧光淬灭封片剂

【酶-显色剂：

酶法检测使用一种酶，如HRP（辣根过氧化物酶）或AP（碱性磷酸酶），与抗体偶联，而后与底物或显色剂联用来完成检测，例如HRP偶联的抗体应用中，一般是过氧化物和DAB（二氨基联苯胺）联用来实现显色。针对酶法检测，选用封片剂时最重要的考虑因素是酶反应的有色产物是否溶于有机溶剂。树脂和非水溶性封片剂（包括甲苯、二甲苯和柠檬烯等）能溶解某些显色剂，导致信号部分或完全丧失。

溶于有机溶剂的显色剂包括：与HRP联用的红色显色剂AEC，与AP联用的固红。当使用这两种显色剂时，请搭配使用水溶性封片剂，并且显色后的切片不要经乙醇和二甲苯脱水处理，直接封片。

DAB不溶于有机溶剂。如果染色后的切片不经脱水处理，可以在DAB染色后使用水溶性封片剂来封片，但大多数选用DAB的实验更倾向于使用经乙醇和二甲苯（或二甲苯替代品）脱水处理的切片，并选用诸如树脂这类非水溶性封片剂来封片。非水溶性封片剂干燥速度快，通常比水溶性封片剂更容易处理。

荧光染色：荧光染色实验建议选用水溶性封片剂。大多数用于组织切片免疫荧光和细胞免疫荧光实验的水溶性封片剂都包含防淬灭剂，其在观察染色结果时，可以减弱荧光素的淬灭。

一些专用于免疫荧光染色实验的封片剂会含有某种荧光核染料，如DAPI和碘化丙啶。这类产品使用上很方便，但并非必要，因为细胞核也可以在封片之前被荧光核染料染色。】

本文整合来源自：公众号abcam

转自：“医学科研小坑”微信公众号

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