2023/5/17 9:30:57 阅读：114 发布者：
以下文章来源于Ad植物微生物 ，作者酵母君
2022年12月，国际权威学术期刊Nature Communications发表了中科院微生物所蔡磊团队的最新相关研究成果，题为Cross-kingdom synthetic microbiota supports tomato suppression of Fusarium wilt disease的研究性论文。
摘要：
根际微生物组在番茄抵抗土传枯萎病（FWD）中的作用尚不清楚。在这里，我们发现FWD发病率与根际细菌和真菌群落的多样性呈显著负相关。利用微生物-培养组学方法，我们选择了205株独特的菌株构建不同的合成群落（SynComs），并使用组学方法监测它们在抑制FWD中的作用。跨界（真菌和细菌）SynComs比单独的真菌或细菌SynComs更有效地抑制FWD。这种效应与植物免疫相关的分子机制以及由细菌和真菌群落促成的微生物相互作用有关。这项研究为微生物群在病原体抑制和宿主免疫相互作用中的动态提供了新的见解。此外，用于功能实现的SynComs的配方和操纵构成了控制土传疾病的有益策略。
引言：
镰刀菌枯萎病（FWD）已经成为导致番茄产量损失的最重要的病害之一，其预防和控制已经成为全球关注的问题。化学杀真菌剂和土壤熏蒸已被广泛用于控制FWD病害。然而，由于它们对人类健康构成威胁并造成环境污染，所以这些方法一直受到批评。开发新的和环境友好的方法对于降低番茄枯萎病的发生率和产量损失至关重要。
在疾病控制和管理中，使用有益微生物群已成为化学剂的替代品。根际微生物群通过支持营养吸收、抗病性和对各种生物和非生物胁迫的耐受性，影响宿主植物的健康。微生物标记基因的扩增测序和宏基因组测序研究揭示了许多与抗病性相关的微生物群落，以及不同微生物群落的共存。植物-微生物和微生物-微生物相互作用的发现和推断基于“组学”数据的关联分析。疾病抑制能力、微生物网络以及协同抑制病原体入侵的有益微生物的富集仍有待验证和研究。
构建合成群落（SynComs）是验证微生物群功能和研究微生物群与宿主植物之间相互作用的一个重要步骤。微生物的分离和培养可以连接扩增子测序数据和功能验证，是阐明微生物群和宿主植物之间相互作用的关键。近年来，培养组学的发展，即采用多种培养条件和培养基中不同的碳和氮源，结合微生物标记基因的扩增测序和其它新技术，极大地提高了我们对可培养微生物多样性的认识，挑战了只有1%的微生物是可培养的范式。尽管有这些技术进步，但与植物相关的培养组学研究是有限的，而且处于发展的初始阶段。以前的研究大多集中在细菌群落上，对真菌群落的报道有限。特别是，真菌群落可以与细菌群落和宿主植物形成共生网络，因此，构建和测试由细菌和真菌组成的合成界间微生物群，对于更好地揭示植物-微生物群的相互作用，以及SynComs抑制FWD的机制非常重要。
在这项研究中，我们假设真菌群落虽然在以前的研究中被忽视，但它与细菌群落一起在维持植物健康以及抗病性方面发挥着重要作用。我们研究了田间和温室环境中生长的番茄FWD的发病率，以及相关的微生物群落，并对田间生长的植物的根际菌和真菌进行了大规模的分离和培养，以全面分析番茄相关的微生物群。在拮抗试验的指导下，我们构建了各种SynComs，并通过群落和网络分析数据，研究它们在无菌番茄幼苗中抑制FWD的能力，并通过多组学方法了解潜在的抑制机制，以及它们随时间的变化和群落的稳定性。该研究将为预防和控制番茄枯萎病和其他土传疾病提供新的见解，为发展绿色可持续番茄产业奠定基础。
结论：
田间和温室番茄的FWD发生率和根际微生物多样性
我们首先评估了中国黑龙江省和山东省的番茄FWD发生率。统计抽样分析显示，温室种植（GH）植物的FWD发生率明显高于自然田间种植（NF）植物（图1a, b）。通过分子方差分析（AMOVA）和多元方差分析（PERMANOVA），根际微生物群落的真菌和细菌组成聚成不同的组，与宿主的生物地理很对应。来自山东省的NF番茄的根际菌群与来自黑龙江省的NF番茄的根际菌群有显著差异。然而，两地GH植物的根际微生物群聚在一起，表明GH植物的微生物群落组成的相似性高于NF植物（图1c，d）。此外，我们发现NF环境中细菌和真菌的α-多样性明显高于GH环境（图1e，f）。相反，两个省的GH番茄根际中的FOL水平都明显高于NF番茄根际（图1g），表明微生物多样性和FOL丰度之间存在负相关关系。
除了微生物多样性和群落组成的差异外，NF和GH微生物组的共生网络也不同（图2a-d）。与GH微生物组相比，NF微生物组网络要复杂得多，平均路径长度更长，节点和边的数量更多，模块化程度更高（图2e，f）。
图1. 自然田间种植（NF）和温室种植（GH）的番茄
，以及不同地点的微生物多样性和群落组成。
普遍的和关键的微生物
接下来，Netshift分析30确认Acremonium、Bacillus、Pseudomonas、Paenarthrobacter、Penicillium、Gemmatimonas、Rhizobium和Sporocytophaga为NF番茄共生网络的关键类群（图2e，f）。综上所述，上述结果表明，NF微生物组比GH微生物组支持更多的相互作用，而且更稳定，因此可能对FWD更有抵抗力。
此外，我们还建立了一个随机森林机器学习模型，以定义生物标志物来区分NF和GH微生物组的属种水平（图2g，h）。经过十倍交叉验证，18个真菌属和16个细菌属的错误率最低，因此被定义为生物标志物分类（图2g-j）。
总之，上述数据表明，在NF和GH环境下，与番茄根际相关的细菌和真菌类群有明显的不同，我们假设在NF番茄根部富集的细菌和真菌物种可以作为潜在的生物控制剂，在抑制番茄的FWD中发挥重要作用。
图2. 根据共现、NetShift和随机森林分析，为SynComs选择细菌和真菌类群。
番茄根际中细菌和真菌的培养
在去除重复后，我们获得了209个独特的细菌和197个独特的真菌，在属的层面上，分别占与番茄根际相关的细菌和真菌zOTU的53.7%和56.3%，表明分离物种的高覆盖率（相对丰度>0.1%）（图3a, b）。然后我们进行了FOL拮抗试验，筛选出有可能抑制FOL生长的细菌和真菌。我们观察到53个不同的细菌菌株和47个不同的真菌菌株强烈地抑制了FOL的生长，分别占目前研究中分离的全部独特细菌和真菌菌株的25.36%和23.86%（图3c，d）。
图3. 番茄根部相关的细菌和真菌培养株，涵盖了通过测序可检测到的大多数物种。
SynComs的动态组成及其在FWD抑制中的表现
SynComs的构建是对关联分析结果进行功能验证并将其转化为现场应用的关键步骤。基于确定的NF富含的分类群、关键分类群、随机森林定义的生物标志物和FOL拮抗试验数据，我们选择了100个独特的真菌（74种不同的真菌）和105个细菌（93种不同的细菌），用于在实验室条件下重建番茄根际微生物群。我们设计了八个不同的SynComs处理组，即没有任何微生物（CK）的对照组、细菌（Bac）SynComs、真菌（Fun）SynComs，以及真菌和细菌（CrossK）SynCom的组合，所有这些都用FOL或不使用FOL进行测试。然后，我们在温室中用不同的SynComs接种无菌番茄幼苗，并跟踪微生物群落随时间的动态变化。成对相关分析表明，番茄SynComs的细菌群落在接种后的第一周（第7天相对于第1天）高度不同（图4a，b）。在接种CrossK CK和CrossK FOL处理后21天，细菌群落逐渐稳定（相关性增加）（图4a，b），另一方面，番茄SynComs中真菌群落的动态与细菌群落的动态显著不同（图4c，d）。真菌群落的相关效率显著高于细菌群落，表明在CrossK和Fun处理中，真菌群落在整个生长期都更稳定（图4c，d）。总之，这些观察结果表明，根际细菌和真菌群落在后期趋于稳定，与细菌群落相比，真菌群落的变化相对较小。
此外，在微生物群和无菌番茄苗共同培养后（图4e-h），在整个生长期间，与对照组相比，SynComs赋予番茄植株明显的抗病性。接种6周后，CrossKFOL组的疾病进展最低，表明跨界的微生物合成群落对疾病的抑制作用突出（图4i）。与疾病发生率一致，测量的FOL水平显示出类似的趋势，应用跨界微生物合成群落导致最低的FOL水平，其次是FunFOL、BacFOL和CKFOL（图4j）。根据分类学注释，在接种后42天，细菌SynComs主要由芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、微球菌科、根瘤菌科、丛毛单胞菌科、鞘氨醇杆菌科、黄杆菌科和莫拉菌科的细菌主导。而真菌类的SynComs主要由来自曲霉科、角单菌科、亚隔孢壳科、肉座菌科、毛刷囊菌科、毛球壳科、腐霉科和丛赤壳科的真菌主导（图4k. i）。这些观察表明，不同的SynComs具有不同的FWD抑制能力，可能有复杂的因素和机制来调节微生物群落的多样性和动态性。
图4. 接种无菌番茄幼苗后不同SynComs成分的相对丰度动态，以及在无菌生长室中生长42天后不同处理下的FWD指数
不同SynComs的群落继承
为了进一步评估番茄生长过程中细菌和真菌群落多样性的变化，我们比较了SynComs的OTU级多样性。在番茄生长过程中，不同SynComs的微生物多样性随时间波动（图5a，b）。经测定，芽孢杆菌、梭菌、肠杆菌、小单孢菌、苍白杆菌、假单胞菌、根瘤菌、鞘氨醇杆菌、芽孢八叠菌、狭窄单胞菌和链霉菌是番茄根际中最丰富的细菌属（图5c, d）。CrossK和Bac SynComs中最丰富的微生物的相对丰度，以及在不同的时间点，是不同的（图5c-f）。在CrossKFOL SynCom中，早期阶段以曲霉菌（6.31%）、镰刀菌（16.08%）、茎点霉（11.23%）、篮状菌（28.77%）和木霉菌（34.82%）为主。曲霉菌（10.62%）、陶氏菌（3.71%）和丝核菌（6.75%）的丰度随时间增加，在晚期与茎点霉（10.53%）、篮状菌（29.19%）和木霉菌（31.26%）一起成为主导（图5e）。总的来说，这些结果表明，不同的SynComs中群落组成和结构的差异可能导致群落继承和稳定的不同趋势。
图5. 接种不同的SynComs后，番茄幼苗中细菌和真菌群落的纵向动态变化。
不同SynComs引发的番茄免疫反应
为了剖析不同SynComs引发的抗病性的信号通路，我们使用逆转录定量实时聚合酶链反应分析茉莉酸（JA）诱导的防御素（LOX）基因和水杨酸（SA）诱导的致病相关蛋白1酸性（PR1α）基因在整个植物生长过程中的表达。LOX和PR1α是植物先天免疫系统的一部分。我们观察到不同SynComs组在不同时间段PR1α和LOX基因的差异表达。与CK处理相比，在CrossK-SynComs处理后，PR1α基因表达显著增加（P<0.001），然后是Fun-SynComs和Bac-SynCom处理（图6b）。这表明CrossK-SynComs最有效地上调了SA相关通路的表达。同样，我们观察到CrossK-SynComs处理的植物中LOX基因表达最高，其次是Bac-SynComs和Fun-SynCom（图6a）。这些观察表明，尽管细菌和真菌群落都显著上调了JA-和SA相关基因的表达，但不同的SynComs在不同的时间段激活了不同的调节机制。
我们还进行了RNA测序来评估番茄对不同SynComs处理的转录反应。在CrossK SynComs、Bac SynComs和Fun SynComs处理中，305、175和253个独特的基因被明显上调（图6d）。我们通过使用基因本体论（GO）分类来分配差异表达基因的功能。在CrossK组，最明显富集的基因被分配到GO术语中，包括细胞对酒精的反应、细胞对脱落酸（ABA）刺激的反应、ABA激活的信号通路、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的调节、水解酶活性的调节、对刺激的反应、氮/磷代谢过程和其他。在Bac SynComs处理后，我们发现JA介导的信号通路调节、对盐胁迫的反应、对热的反应、对渗透胁迫的反应、对过氧化氢的反应和温度刺激的GO术语明显富集。最后，包括磷代谢过程、碳水化合物分解代谢过程、蛋白质自体磷酸化、有机酸分解代谢过程、蛋白质磷酸化和磷酸化等途径在接种Fun SynComs的番茄中明显富集（图6c）。
接下来，我们使用宏基因组学来确定不同SynComs的功能特性。关于CAZ途径，与Fun SynComs相比，CrossK SynComs和Bac SynComs中的岩藻酸内切酶、甲壳素酶和海藻酸裂解酶的相对丰度明显较高，表明它们在细菌群落提供的FOL抑制中具有潜在的重要作用（图6e）。综上所述，这些数据表明，FWD的发病率与根际菌和真菌群落的多样性明显相关，与Fun SynComs和Bac SynComs相比，CrossK SynComs对抑制FWD最为有效。这种效果是由与植物免疫有关的分子机制以及细菌和真菌群落提供的微生物相互作用共同支撑的。
图6. 基于实时反转录定量聚合酶链反应、转录组测序和宏基因组测序，不同SynComs组中植物转录的相对丰度和生物标记基因的表达。
讨论：
植物根际微生物群在植物抗逆性和病原体抑制中发挥重要作用，是植物防御反应的主要驱动因素。有很多证据表明，疾病的抑制是微生物群落集体活动的结果，而不是单个细菌或真菌物种的结果，高度多样的微生物群落比任何单独的微生物分类更有效地激发抗病性。在这项调查中，我们证明了无论地理位置如何，FWD发病率随着细菌和真菌多样性的增加而显著降低。除了微生物群落多样性和组成的差异外，我们的数据还显示了田间番茄和温室番茄之间微生物共生网络的显著差异。所有这些研究都指出了微生物组在维持植物健康和疾病抑制中的作用。尽管已经提出了它们的作用和相关性，但这些生物标志物、核心微生物群或潜在有益类群的保护机制和功能作用仍需通过基于培养的方法在原位单独和集体验证。
我们从番茄根际中分离并鉴定了50%以上的细菌和真菌，扩大了番茄根际中的可培养微生物库。细菌和真菌在激活番茄先天免疫系统、营养/生态位竞争和分泌杀真菌化合物中的不同作用，突出了Bac和Fun SynComs不可替代的功能作用。
该研究有一些局限性。首先，尽管我们分离了许多高丰度的细菌和真菌物种，但许多低丰度的微生物没有被包括在内。此外，在未来的体内研究中，低丰度的关键微生物应被纳入SynComs。虽然超出了目前的研究范围，但在未来的研究中可以尝试创新的方法，如基于微流控技术的培养、基于膜扩散的培养和基于细胞分选的培养，以分离这些稀有的微生物，包括一些迄今未培养的真菌和细菌。其次，本研究在实验室环境下分析了跨界SynComs的抑制能力，这种抑制实验随后应在温室生产农业实践中得到验证。
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