一文优化！PCR 反应体系与循环参数

PCR 条带拖尾、没条带、数据不稳定、出现引物二聚体，是 PCR 实验常见问题。

我们可以通过「PCR 反应体系」的调整，解决以上问题，包括调整：变性温度和时间、复性温度和时间、延伸温度和时间、循环数等参数。

如何优化 PCR 反应体系？

「进阶」

PCR 缓冲体系优化

除了 PCR 时间以及循环参数设置外，还可以通过优化缓冲体系，来得到稳定的实验数据。

1、缓冲液

标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl ， pH 为 8.3-9.0（室温），Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。

2、脱氧核苷三磷酸（dNTP）

脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）。dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。

3、引物

在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即 1pmol/ml 。如果 5% 用于扩增 1kb 的 DNA 片段，可得到 3.3 μg 的产物，足以用于常规分析。

引物设计一般要考虑以下几个问题：长度、引物的解链温度、避免引物内部或引物之间存在互补序列（3 个碱基），从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成、G+C 含量等等。

转自：“生物学霸”微信公众号

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