NC | 科学家发现一类可进行RNA靶向，且具有特殊的引导结合机制和切割特异性的新型细菌Argonaute核酸酶

两种主要类型的可编程核酸酶，CRISPR-Cas和Ago (Argonaute)蛋白，在遗传免疫系统中发挥核心作用。真核Argonautes蛋白(eAgos)在RNA干扰(RNAi)中发挥核心作用，并利用向导RNA靶向RNA，参与基因调控。原核生物的Argonautes（pAgos）蛋白质比真核生物的Argonautes（eAgos）更多样，且大多数研究的原核Ago (pAgo)核酸酶对DNA向导和DNA靶标具有天然特异性，而一部分CRISPR相关的pAgos可通过向导RNA靶向DNA。研究表明，一些pAgos也能在体外结合和切割RNA靶标，但其速率低于切割DNA靶标，没有pAgo对RNA靶标有明显的偏好性。

由于pAgos蛋白分子量相对较小，以及在引导结合或靶标识别过程中对特定的序列没有要求，有潜力成为基因编辑技术的工具，因此寻找具有未被发现的特异性的pAgos不仅对理解它们的生物功能和RNAi的进化具有重要意义，而且发展生物技术也具有重要意义。然而，尽管pAgos种类繁多，但其作用机制和细胞功能的研究才刚刚开始，以往的pAgos研究仅限于DNA靶标。

近期，科研人员在国际学术期刊Nature Communications上在线发表了题为“Programmable RNA targeting by bacterial Argonaute nucleases with unconventional guide binding and cleavage specificity”的研究论文，在这项研究中，研究人员发现了一类新的pAgos，通过向导DNA靶向RNA，通过对其进行生化和结构分析，证明这些pAgos具有一种新型的MID结构域，并解释了观察到的切割偏好。这种新型可编程核酸酶在生理温度下具有活性，可作为靶向RNA的可编程核酸酶工具。

为了找到具有特异性的pAgos，研究人员研究了其系统发育树中以前未探索分支的pAgos的活性，确定了两组以前没有被研究过的长pAgos，并从这两组中选择了4个pAgo蛋白进行进一步表征，发现这些pAgos属于一类新的可编程核酸酶，利用DNA向导识别和切割RNA靶标，并将这组核酸酶命名为D-R pAgos。这4个pAgos由中温细菌编码，在30 - 44℃之间的活性最高，37°C的反应速率与之前报道的其他pAgos组的切割速率相当，此外，这四种蛋白都对Mg2+和Mn2+有活性，但对其他测试的二价阳离子没有活性。

引人注目的是，来自第一组pAgos的PliAgo和RslAgo的RNA切割位点与来自第二组的PnyAgo和HpeAgo，以及先前研究的来自原核生物和真核生物的Ago蛋白相比发生了偏移。典型的切割位点位于目标位置10 '和11 '之间，对应于向导链5 '端的第10和第11个核苷酸，但PliAgo和RslAgo的RNA切割主要发生在9 '和10 '之间，也就是靠近向导链5 '端的核苷酸。因此，这类pAgo蛋白可能利用一种不同寻常的机制来引导结合和靶标识别。

通过对PliAgo的生物化学和结构分析，研究人员发现PliAgo具有一种新型的MID结构域，其不结合二价阳离子，也不使用C端羧基与向导DNA相互作用。与已知的Argonautes相比，PliAgo与向导DNA的5 '-磷酸基团相互作用确定了其在 pAgo中的新位置，并改变了靶标RNA的切割位点，RNA相对于DNA的特异性是由切割位点上的核苷酸残基确定的。分析后的pAgos检测到靶标RNA的错配和修饰。这一结果拓宽了我们对原核防御系统的理解，而且为靶向RNA的可编程核酸酶工具提供了新的选择。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-32079-5

转自：植物生物技术Pbj

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