NC | 一种新型小分子量和高精准度（低脱靶）胞嘧啶碱基编辑系统的开发与利用

胞嘧啶碱基编辑能够在DNA中安装特定的点突变而不会出现双链断裂，并且有利于基因治疗等各种应用，但需要进一步降低脱靶风险并开发有效的递送方法。在这里，他们展示了胞嘧啶碱基编辑系统 Target-AID 的基于结构的合理工程，以最大限度地减少其脱靶效应和分子大小。通过密集和仔细的截断，其脱氨酶PmCDA1的DNA结合域被消除，并引入了额外的突变以恢复酶功能。由此产生的tCDA1EQ在与Cas9的N端融合(AID-2S)或镶嵌结构(AID-3S)中是有效的，显示最小化的RNA介导的编辑和gRNA依赖/独立的DNA脱靶，正如在人类细胞中评估的那样。

近期，日本神户大学科研团队在国际学术期刊Nature Communications上发表了题为“Cytosine base editing systems with minimizes off-target effect and molecular size”的研究。

对于遗传疾病的治疗，碱基编辑被认为是一种有前途的药物，因为它可以安装特定的SNV 而不会诱导DNA双链断裂或模板DNA。体内递送一直是在目标组织上实现高效和特异性编辑的主要瓶颈之一，较小的分子大小尤其有利于体内递送工具，例如腺相关病毒(AAV) 载体。AAV载体是一种有前途的基因治疗递送方法，具有更高的安全性和效率，尽管其 DNA载体大小限制(4-5 kb)阻碍了包括碱基编辑在内的更广泛应用。对于传统的基因组编辑，较小的CRISPR直系同源物金黄色葡萄球菌(Sa) Cas9促进了单个AAV载体的开发，但添加脱氨酶结构域一直具有挑战性。不是组成单个AAV载体，碱基编辑组件可以拆分为两个AAV载体以规避大小限制。在这项研究中，他们解决了胞嘧啶碱基编辑系统Target -AID 的基于结构的合理工程，以最大限度地减少其脱靶效应和分子大小，并展示单 AAV介导的胞嘧啶碱基编辑能力。

DNA 脱氨酶对 DNA 具有内在的亲和力并导致非特异性脱氨。hAID 是PmCDA1 的人类同源物，其结构揭示了其在与催化核心18不同的区域中与双链 DNA 形成复合物（图 1a）。基于 hAID 和 PmCDA1 的氨基酸比对，PmCDA1 的潜在 DNA 结合部分位于蛋白质总208个氨基酸 (aa) 长度的 21-27 和 172-192 残基上（图1a）。为了删除预测的DNA结合区域，他们首先从C末端进行了一系列截断并在酵母酿酒酵母（BY4741）细胞中测试了它们的碱基编辑活性。为了反映它们在动态范围内脱氨酶活性的变化，他们故意省略了尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂 (UGI)，这很容易将突变率提高到酵母中的饱和水平。接下来，他们通过融合到nCas9的N端，从1-161版本的N端进行了一系列截断。CDA1（1-161）的N末端截断首先显示出进一步降低的活性，然后随着截断进行到21和28 aa而恢复。蛋白质的预测结构表明同时截断 N-和C-末端使横截面最小化，并提供更光滑的蛋白质表面，减少疏水残基的暴露。进一步截断 CDA1（30-150），预计它是最小的，疏水表面暴露最少，同时保持其酶核心结构域完整，显示出恢复的活性（图1b）。这些结果表明，它们编辑活性的变化归因于蛋白质的构象稳定性。为了进一步提高其活性，他们对截断后暴露的疏水残基引入了一系列突变。在第一轮中测试了六个突变，发现W122E显着增加了对CDA1（30-150）的活性。与W122E组合测试了另外的七个突变，以发现W139R/Q的活性进一步提高。含有W122E和W139Q的CDA1(30-150) 以下称为tCDA1EQ。

接下来，他们评估了人类HEK293T细胞中AID-2S和AID-3S的编辑效率和窗口，并将它们与现有改进的胞嘧啶碱基编辑器YE1、YE2 和R33A +K34A进行了比较，据报道这些编辑器表现出脱靶效应的降低。通过质粒DNA载体转染编辑八个随机靶向位点，并通过扩增子深度测序进行分析。相对于PAM序列的每个核苷酸位置处胞嘧啶的编辑效率显示在平均 Target-AID 能够对所有站点执行>20%的编辑。除了位点8，AID-2S、AID-3S、YE1 和YE2也表现良好。R33A + K34A 表现出目标依赖性，仅在位点3、4和7中获得>20% 的编辑。AID-2S表现出较窄编辑区域，而AID-3S显示与原始Target-AID相比，编辑窗口向PAM序列的近端移动。

DNA和RNA 脱靶效应也是碱基编辑的问题。从本质上讲，基于APOBEC的碱基编辑器具有RNA编辑能力，可导致不依赖gRNA和依赖gRNA的RNA脱靶效应，这有助于开发具有改进特异性的几种变体。为了评估新变体，他们对三个mRNA 位点（图 3a、CTNNB1、RSL1D1 和 IP90）进行了靶RNA测序，据报道其表现出高gRNA非依赖性脱靶8和六个gRNA依赖性mRNA位点。据报道，BE4max表现出的不依赖gRNA和依赖 gRNA的RNA编辑都被所有其他测试的变体显着降低，而YE1在几个位点保留了可检测的 RNA脱靶（图 3a）。原始的Target-AID和新的变体没有显示出明显的RNA脱靶，这与之前的报告一致。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-32157-8#MOESM1

转自：植物生物技术Pbj

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