Current Biology | 青岛农业大学梁文星教授团队针对病菌ROS清除机制开发新型广谱抗菌剂

植物病原菌感染导致的植物病害对全球农业可持续发展和粮食安全造成了严重威胁。使用农药是应对植物病害的常见方法，然而有效杀菌剂数量有限而且使用频繁，导致病原菌产生耐药性的问题也日益严重。因此，解析病原菌致病机制，并开发出针对这一过程的新型化学药物尤为迫切。

灰霉菌（灰葡萄孢菌Botrytis cinerea）是一种通过空气传播的死体营养型植物病原真菌，它可以侵染全球200多种农作物，诱发农作物产生灰霉病，导致植株落叶、猝倒、花腐、烂果等，灰霉病严重危害农业生产，并造成巨大经济损失。

活性氧迸发（Oxidative burst）是植物面对病原菌攻击的快速防御反应之一。活性氧（ROS）包括超氧化物和它的前体H2O2, ROS既可以引发植物超敏反应和局部细胞死亡以阻止病原菌侵染，也能够充当信号分子激活防御相关基因表达。为了能够成功侵染，病原菌需要抑制ROS的产生或者对产生的ROS及时清除。过氧化物酶在植物真菌病原菌的毒力方面有重要作用。灰霉菌中已经发现了一些过氧化物酶能够降低宿主的ROS水平，然而迄今为止很少有ROS解毒药物被开发用于控制植物真菌病害。

2022年8月5日，Current Biology在线发表了青岛农业大学植物医学学院梁文星教授团队题为“Broad-spectrum chemicals block ROS detoxification to prevent plant fungal invasion ”的研究论文。该研究表明灰霉菌分泌的细胞色素c-过氧化物酶(cytochrome c-peroxidase) BcCcp1能够去除植物产生的H2O2并促进病原菌侵染。BcTol1调节BcCcp1的分泌，作者鉴定的两种能够靶标BcTol1的小分子不仅能够有效预防灰霉菌和其他真菌病原菌侵染，而且施加该小分子对农作物没有产生明显负面影响。

该团队前期的研究结果表明位于BcTol1的N端VHS结构域中的122位赖氨酸残基是潜在的乙酰化修饰位点。为了确认该位点，本文中作者定点突变模拟该位点乙酰化（K122Q）和非乙酰化（K122R），并使用针对K112位点乙酰化的特异性抗体检测，结果表明，K122确实是该蛋白的乙酰化位点。作者通过系统发育树以及氨基酸序列比对发现K122在多种真菌致病菌中的9个Tol1中十分保守。为了研究BcTol1是否参与调节灰霉菌的毒力，作者发现BcTol1转录本及其蛋白产物在感染早期显著增加，在感染后24小时达到最大值，乙酰化修饰蛋白也在感染后6-12小时处于较高水平，24小时后水平降低。作者使用BcTol1缺失突变体菌株、模拟乙酰化（K122Q）和非乙酰化（K122R）菌株以及回补菌株一同侵染绿豆叶片和番茄果实，结果表明BcTol1缺失菌株和模拟乙酰化（K122Q）菌株侵染植物的能力明显减弱。作者在培养基中施加20 mM浓度的H2O2培养B05.10菌株及其相关突变体，结果发现BcTol1不能正常表达或者不能去乙酰化时，会导致培养基中的H2O2水平较高，清除ROS能力减弱。DAB（diaminbezidin）染色也证实了这种侵染能力与其H2O2的清除能力关系密切（图1）。总之，作者发现BcTol1及其去乙酰化的状态对其侵染能力十分重要。

酵母双杂交实验表明BcTol1能够直接与泛素结合。作者利用LC-MS/MS技术找到了357个潜在的BcTol1互作蛋白，结合其ROS的耐受能力，作者最终选择BcCcp1进一步研究。Y2H和Co-IP的结果表明，BcTol1可以与泛素化的BcCcp1互作，并且BcTol1的K122以及BcCcp1的K101对于两者互作十分重要。作者检测到BcCcp1能够被灰霉菌分泌，BcTol1与其直接互作调控分泌过程，BcTol1的K122乙酰化负调控了该过程。

作者研究了BcCcp1对灰霉菌侵染能力的作用，发现BcCcp1缺失菌株以及两个H131L和K101A突变菌株对培养基中H2O2水平十分敏感，DAB染色表明其侵染时植物叶片H2O2水平也较高，侵染植物能力减弱。这说明BcCcp1以及H2O2的解毒机制对于灰霉菌侵染能力至关重要。Co-IP实验表明乙酰基转移酶Rtt109能够与BcTol1互作。过表达BcRtt109菌株以及体外乙酰化实验结果表明Rtt109能够提高BcTol1的乙酰化水平。作为BcTol1的负调控因子，BcRtt109的过表达略微增加了灰霉菌的生长速度，但降低了其毒力。

BcTol1对BcCcp1分泌的严格控制使其成为一个有潜力的杀菌剂靶点。有意思的是，通过对ChemDiv数据库的筛选，作者确定了2种化学物质，5664-0417和6623-1943，它们可能以BcTol1的VHS结构域为靶标。在接种灰霉菌的同时施用10mM这些化学物质，可使病害减少高达81%（图2）。施用5664-0417和6623-1943也可防止灰霉病菌入侵番茄果实。用5664-0417或6623-1943处理完全破坏了BcTol1和BcCcp1的相互作用，在很大程度上消除了BcCcp1分泌，并导致灰霉菌的抗氧化能力受损。进一步的1-15mM剂量梯度实验表明，用5.87mM 5664-0417或5.03mM 6623-1943治疗可减少50%的病害损伤。此外，在绿豆上施用100mM这两种化学品不会造成明显的生长缺陷。总之，这些结果表明，以BcTol1为靶点抑制活性氧解毒的化学物质是控制灰霉病的潜在有效杀菌剂。作者进一步研究表明这两种小分子对于防治其他真菌侵染具有广谱抑制作用，而且100mM浓度对水稻、小麦和番茄都没有明显负面影响。

总之，作者发现灰霉菌分泌BcCcp1去除植物产生的H2O2并促进病原菌侵染。BcTol1在感染早期受到不同水平的调节，以增强BcCcp1的分泌。BcTol1或BcCcp1的失活导致灰霉菌的毒力显著降低。作者鉴定了两种BcTol1靶向的小分子，它们不仅可以防止灰霉菌的入侵，而且对多种植物真菌病原体具有有效的活性，对宿主没有显著的不良影响。这些发现揭示了真菌中活性氧解毒的保守机制，并提供了一类潜在的杀真菌剂来控制各种植物疾病，这对相关领域的进一步药物发现具有广泛的意义。

ACKNOWLEDGMENTS

青岛农业大学植物医学学院杨倩倩副教授和中国农业科学院烟草研究所杨金广研究员为论文的共同第一作者，梁文星教授为本文的通讯作者，剑桥大学Ben F. Luisi教授对本研究提供了重要指导。该研究得到了山东省自然科学基金（ZR2020KC003）、山东省外专双百计划（WST2018008）、国家自然科学基金（31972213）和山东省泰山学者（tshw20130963）项目的支持。杨金广研究员得到了烟草绿色预防和控制项目110201901041（ls-04）的支持。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096098222201123X?via%3Dihub

转自：植物生物技术Pbj

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