PBJ | 通过CRISPR/Cas9系统精准调控微藻运动能力相关基因，使其处于静态生长状态，能显著提高收获量！

裸藻属也称眼虫藻属。植物体为单细胞，呈纺锤形至针形，多数种类表质柔软，可变形。常见的种类有绿色裸藻，血红裸藻，中型裸藻，旋纹裸藻，纤细裸藻等。营养丰富的纤细裸藻广泛应用于食品、化妆品和饲料等行业。在静态环境下大规模培养更容易获得需要的原料，微藻运动的精确遗传操作仍然具有挑战性。

近日，日本横滨科技创新中心在Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“CRISPR/Cas9-mediated generation of non-motile mutants to improve the harvesting efficiency of mass-cultivated Euglena gracilis”的研究论文，该研究表明敲除纤细裸藻中的EgBBS基因可以提高收获效率，并且不会对生产力产生负面影响。

本文作者使用基于Cas9核糖核蛋白（RNP）的基因组编辑技术，对纤细裸藻中BBS基因进行编辑获得非运动菌株。并鉴定了编码秀丽隐杆线虫的BBS-7或BBS-8同源蛋白质的基因。这些BBS基因与鞭毛内运输有关，并介导纤毛/鞭毛的运输；。作者设计了两对靶向EgBBS7和EgBBS8不同区域的单导向RNA（sgRNA），并通过电穿孔将Cas9–sgRNA RNP复合体导入纤细裸藻中。

作者对突变体中EgBBS7和EgBBS8靶标位点进行检测，sanger测序证实大的基因组区域被删除，包括内含子区域。当分离的单个细胞进行培养时，所有8个bbs株突变菌株呈现非运动状态，而WT可以自由扩散（图1e）。作者通过扫描电子显微镜确认突变菌株的非鞭毛虫表型，并通过定量电泳测定方法确认其非运动性。结果表明，EgBBS7和EgBBS8有助于在中纤细裸藻形成全长鞭毛，是运动所必需的基因，之后，作者还通过成像方法评估了非运动bbs突变体的重力沉降（图1j），发现bbs突变体能够快速沉降（图1k），同时还发现在烧瓶沉淀后120分钟，WT培养物保持浑浊，而bbs突变体细胞几乎完全沉淀（图1l）；并且在烧瓶沉降后100分钟，比较bbs突变体和WT沉积物的干重，发现bbs突变体的沉降率比WT高32-38%（图1m）。

最后，作者还检测了WT和bbs突变体的生长、生物量、蛋白含量和脂质含量。发现在KH培养基中培养的细胞密度作为生长估计，在KH培养基中培养4天后，所有四种bbs菌株的生长率与WT没有显著差异，但在培养开始7天后，bbs8突变体的细胞浓度略高于WT的细胞浓度（图1n）。在培养开始7天后收获的生物量或在有氧或缺氧条件下细胞的脂质含量方面，我们没有检测到bbs突变体和WT之间的存在显著差异（图1o，p）。这些结果表明，促进沉淀的EgBBS基因突变不会对生物量或高价值产品的生产产生负面影响。因此，作者认为敲除纤细裸藻中的EgBBS基因可以提高收获效率，同时不会影响其生物量及生产力。

原文链接：

https://doi.org/10.1111/pbi.13904

转自：植物生物技术Pbj

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