环状RNA（circRNA）最初是在30多年前发现的，但长期以来一直被认为是 mRNA 剪接过程的副产物，没有特定功能。2013年2月27日，Nature 同期发表两篇论文【1、2】，circRNA 可以作为 miRNA 的海绵在细胞中调控基因表达。此后，circRNA 论文大爆发，成为新一代的明星分子。
2018年，麻省理工学院（MIT）的 Daniel Anderson 等人在 Nature Communications 发表论文【3】。该研究证实工程化 circRNA 可在真核细胞中稳定、高效表达蛋白，开创了外源 circRNA 在真核细胞中表达蛋白的新应用，也证明了 circRNA 是线性 mRNA 的有效替代品。
新冠疫情以来，mRNA 疫苗大获成功，同时，基于 circRNA 的 mRNA 疫苗研发公司开始出现，例如 Orna Therapeutics、Laronde，以及国内的环码生物、圆因生物、科锐迈德等公司先后成立，并受到广泛关注。
2022年7月18日，斯坦福大学张元豪（Howard Y. Chang ）团队在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Engineering circular RNA for enhanced protein production 的研究论文【4】。
研究团队开发了一种系统方法，用于快速组装和测试影响合成 circRNA 的蛋白质生产的因素。
通过多处优化设计最大限度提高 circRNA 翻译蛋白质的效率，成功将 circRNA 翻译表达的蛋白质产量提高了数百倍，可在体内实现有效且持久的蛋白质生产。
RNA 疗法，包括 mRNA、siRNA、miRNA，已经成为继小分子、生物制剂和细胞疗法后的现代医学新支柱。新冠 mRNA 疫苗的成功，让 mRNA 疫苗和疗法受到广泛关注。
人工合成的 circRNA，以及部分内源性 circRNA 可以编码蛋白质（或多肽），这为使用 circRNA 作为基因表达平台奠定了基础。因此，将 mRNA 环化为 circRNA，利用其稳定性来延长蛋白质翻译的持续时间，引起了相当大的兴趣。
目前，已经在长链 RNA 的合成和环化为 circRNA 方面取得了相当大的进展，然而，circRNA 和线性 mRNA 翻译起始的基本机制不同，深入了解 circRNA 的翻译起始机制，对于构建更好的 circRNA 疗法、超越 mRNA 的蛋白翻译能力至关重要。
在这项最新研究中，研究团队创建了一个模块化的高通量平台来制造和测试合成的 circRNA。使用该平台，研究团队系统比较了 circRNA 表达如何受 N6-甲基腺苷（m6A）掺入、载体拓扑结构、终止密码子数量、5' 和 3' 非翻译区（UTR）、核糖体进入位点（IRES）和合成适体（Synthetic Aptamers）等因素的影响。
为了最大限度地提高 circRNA 的蛋白质翻译效率，研究团队优化了五个要素：载体拓扑结构、5' 非翻译区、3' 非翻译区、核糖体进入位点（IRES）和招募翻译起始的合成适体。
通过优化和组合这些元素，研究团队成功将 circRNA 翻译的蛋白质产量提高了数百倍（224倍），在体外具有比线性 mRNA 更高的翻译效率，在体内能更持久的翻译。
研究团队用上述优化的 circRNA 编码荧光素酶 NanoLuc 并注射到小鼠腹膜内，使用电荷改变可释放转运体（Charge-Altering Releasable Transporters，CART）递送，实验结果显示，小鼠在至少一周内表现出很强的荧光，这表明工程化 circRNA 可在体内长期稳定表达蛋白质。而且，在第一次注射两周后，再次注射后，荧光素酶 NanoLuc 的表达和荧光发光水平与第一次注射时没有差别，这表明这种工程化 circRNA 可以重复给药。
接下来，研究团队使用优化的 circRNA 来编码人促红细胞生成素（hEPO，一种用于治疗贫血的分泌蛋白），并与线性 mRNA 对比。在给小鼠静脉注射后，血浆中 circRNA 表达的 hEPO 蛋白水平在最初低于 mRNA 表达的水平，但48小时后，mRNA 的表达迅速下降，而 circRNA 的表达能够维持稳定，至少能稳定到96小时。
注射一周后，接受 circRNA 编码的 hEPO 的小鼠的网织红细胞（Reticulocyte，红细胞的未成熟阶段，是反映骨髓红系造血功能以及判断贫血和相关疾病疗效的重要指标）技数量显著增加，而 注射 mRNA 的小鼠的网织红细胞水平与未接受任何治疗的小鼠相比没有差异。
总的来说，该研究通过多种优化，将 circRNA 翻译表达的蛋白产量提升了数百倍，证实了工程化 circRNA 可以在体内以与线性 mRNA 相似的强度表达蛋白，但 circRNA 的表达更稳定、持续时间更长，从而表达更大量的蛋白。
张元豪，斯坦福大学教授，HHMI研究员，美国国家科学院院士，美国艺术与科学院院士
论文链接：
1.https://www.nature.com/articles/nature11928
2.https://www.nature.com/articles/nature11993/
3.https://www.nature.com/articles/s41467-018-05096-6
4.https://www.nature.com/articles/s41587-022-01393-0
转自：生物世界
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