Genome Biol | 浙江大学谢安勇团队发现CRISPR/Cas9影响DNA双链断裂修复新机制

由于CRISPR/Cas9-sgRNA复合物在其靶标处裂解后驻留，CRISPR/Cas9诱导的DNA双链断裂 (DNA double-strand breaks, DSB) 必须暴露才得以参与DSB修复途径。Cas9-sgRNA与靶标的相互作用决定了其对的靶标结合亲和力，并调节裂解后靶标停留时间和Cas9诱导的DSB暴露。DSB暴露在不同机制介导下，可能引发可变的DNA损伤反应，从而影响DSB修复途径的选择，并导致基因组编辑中的突变异质性。然而，人们对DSB修复途径选择的这种调节知之甚少。

2022年8月1日，浙江大学谢安勇团队在Genome Biology 发表题为“Target residence of Cas9‐sgRNA influences DNA double‐strand break repair pathway choices in CRISPR/Cas9 genome editing”的研究论文。该研究发现在修复CRISPR/Cas9诱导的DNA双链断裂时，修复途径的选择在不同的靶位点差异很大，经典的非同源末端连接 (c-NHEJ) 甚至不参与某些位点。在小鼠胚胎干细胞中，减弱Cas9-sgRNA 与靶标的相互作用会促进对c-NHEJ的偏向并增加靶标解离，并减少Cas9-sgRNA在体外的靶标驻留。作为增强同源定向修复的重要策略，c-NHEJ的失活由于其与脱靶位点的弱相互作用而加剧了Cas9-sgRNA的脱靶活性。通过将Cas9-sgRNA从其切割的靶标中移出，DNA复制会改变DSB末端配置并抑制c-NHEJ有利于其他修复途径，而转录对c-NHEJ接合几乎没有影响。通过DNA复制将Cas9-sgRNA从其切割的靶标上解离可能会产生三端DNA断裂，从而导致姐妹染色单体的回文融合，这是CRISPR/Cas9诱导的靶向染色体重排的潜在来源。

总之，该研究证明Cas9-sgRNA的靶向驻留可能通过Cas9-sgRNA从切割的DNA的不同解离来调节 DSB 修复途径的选择，从而扩大CRISPR/Cas9基因组编辑中的靶向和脱靶突变谱。

CRISPR/Cas9 基因组编辑依赖于Cas9核酸酶与single guide (sgRNA)复合物与DNA靶标的结合，以诱导位点特异性DNA双链断裂 (DSB) 及其随后的损伤修复。在Cas9诱导双链断裂后，不同的修复途径竞争修复断裂双链，以此实现DNA编辑，包括各种修复产物之间的替换、插入、缺失或易位。哺乳动物细胞中两种主要的DSB修复机制包括非同源末端连接 (nonhomologous end joining, NHEJ) 和同源定向修复 (HDR)。

虽然经典NHEJ (classical NHEJ, c-NHEJ) 是主要的NHEJ通路，但如果包括 DNA-PKcs、Ku70/Ku80和XRCC4/DNA连接酶4在内的任何一个核心NHEJ 因子缺乏或未接合，也可以使用替代末端连接 (alternative end joining, a-EJ) 重新连接DSB的末端。如果DSB的末端易于连接，例如Cas9诱导的平端和3'-悬垂末端，则c-NHEJ 会产生大部分准确的末端连接产物，而a-EJ主要大部分是诱变的。此外，使用同源序列作为模板，HDR是CRISPR/Cas9基因组编辑中准确替换和插入的首选途径。

DNA双链断裂修复途径的选择受许多因素影响，包括细胞周期阶段、DNA 末端配置、周围染色质环境和局部DNA代谢，CRISPR/Cas9诱导DSB的独特性也可能参与这一调控。在CRISPR/Cas9基因编辑中，将Cas9靶向给定位点是由多种相互作用介导的，包括Cas9与靶标的原型间隔区相邻基序 (PAM) 之间的接触、sgRNA 间隔区与靶链的碱基配对和非特异性Cas9与靶DNA之间的相互作用。体外和体内研究表明，这些相互作用需要Cas9-sgRNA复合物与其靶标强烈而持久的结合，即使Cas9诱导的DNA切割后，也有助于其在靶标靶标停留数小时。Cas9诱导的DNA双链断裂修复通常很慢，在哺乳动物细胞中通常持续20小时以上，这可能是由于保留在切割DNA上的Cas9-sgRNA复合物隐藏了断裂位置。由于介导Cas9-sgRNA与其靶标相互作用的内在差异，Cas9-sgRNA的结合亲和力在不同位点随着靶标位置的改变而变化。Cas9-sgRNA很可能会从其靶标中自发释放，或者可能会遇到局部DNA复制、转录或染色质重塑，导致Cas9-sgRNA从切割的DNA中释放并暴露断裂位置。断裂位置随后被识别并与决定通路选择的修复因子结合。因此，Cas9-sgRNA在靶标驻留可能调节CRISPR/Cas9在基因编辑中DNA双链断裂修复途径的选择，然而这一假设还有待检验。该研究发现经典非同源末端连接 (c-NHEJ) 的参与程度在修复Cas9诱导的不同DNA断裂位点之间存在差异。在相同的Cas9诱导的断裂中，减弱Cas9-sgRNA与靶标的相互作用会促进偏向选择c-NHEJ修复方式。体外实验表明，减弱靶标相互作用能够促进靶标的解离，并缩短了Cas9-sgRNA在切割和未切割DNA处的靶标停留时间。抑制c-NHEJ通常用于增加HDR介导的 CRISPR/Cas9基因编辑，因为Cas9-sgRNA 和脱靶位点之间的相互作用较弱，从而提高了CRISPR/Cas9的脱靶效应。

局部DNA复制而不转录，能够通过去除仍与其切割靶标结合的Cas9-sgRNA，并产生不适合c-NHEJ的三端断裂来促进a-EJ和HDR。三端断裂修复可能导致姐妹染色单体的回文融合，这是染色体断裂-融合-桥循环的关键步骤，也是CRISPR/Cas9基因组编辑中染色体重排的潜在来源。由于CRISPR/Cas9 基因组编辑产生的高度异质性修复产物，Cas9-sgRNA 的驻留对其靶位点和脱靶位点的DNA双链断裂修复途径选择可能会促成更显著的突变异质性。

参考消息：

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-022-02736-5

转自：硕博一线

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