【学术笔记】相分离调控Wnt受体信号小体和β-catenin 破坏复合物的装配
记录人：罗杰琛 孔道春实验室
2023年03月30日下午，受北大-清华生命科学联合中心孔道春教授邀请，南昌大学校长、清华大学生命科学学院教授陈晔光院士在北京大学金光生命科学大楼邓祐才报告厅带来一场题为“Phase separation regulates the assembly of the Wnt receptor signalosome and the β-catenin destruction complex”的精彩报告。
孔道春教授介绍陈晔光院士
陈晔光院士做报告与交流
【概要】
Wnt/β-Catenin 通路能够调节干细胞的多能性，并且在发育过程中决定细胞的分化命运。经典的Wnt/β-catenin信号通路中，在无Wnt信号时，细胞内β-catenin蛋白由于destruction complex(破坏复合物)介导的降解从而处于低水平状态。Destruction complex主要由折叠蛋白Axin和APC，磷酸激酶GSK3β和CK1α组成，该复合物通过磷酸化β-catenin进而促使其被泛素化后降解（图一 A）。而在Wnt信号存在时，会刺激诱导受体（Frizzled，LRP5/6）关联的signalosome（信号小体）的装配并通过招募Dvl蛋白使得destruction complex失活，进而导致β-catenin的累积入核和靶向基因的转录激活（图一B）。然而科学界目前对于Axin如何组织destruction complex以及Dvl如何促进signalosome形成的具体机制尚不明晰。LLPS(liquid-liquid phase separation，液液相分离)是一种特定的让细胞内的相关分子聚集并在一定区域内发挥功能的方式，在“混乱的”细胞内部形成一定“秩序”，为解决困扰了大家多年的细胞分子生物学相关问题提供了一个全新的思路，能在体内和体外发生LLPS的蛋白通常含有IDR（内在无序区域）和LCS（低复杂度序列）[1]。陈晔光院士团队研究发现destruction complex的形成是通过蛋白质的LLPS(liquid-liquid phase separation, 液液相分离)驱动的。相分离的Axin1作为支架蛋白招募GSK3β，CK1α和β-catenin，促进激酶GSK3β介导的β-catenin的磷酸化（GSK3β磷酸化S33，S37和T41而CK1α磷酸化S45）而后被泛素化降解。研究者在体外发现APC蛋白同样通过LLPS增加了Axin的phase droplet（相液滴）的大小和动态变化进而推动destruction complex的功能发挥[2, 3]。此外，研究者在Wnt信号存在时发现，signalosome 支架蛋白Dvl在signalosome其余组分Fzd5、LRP6和Axin1的推动下发生LLPS。Dvl通过其LLPS性质在Wnt刺激下被招募到细胞质膜上，进一步招募Axin至质膜处，减弱Axin的LLPS性质，从而破坏相分离形成的destruction complex，促进Wnt受体signalosome的形成[4, 5]。
图一，经典Wnt/β-cantenin信号通路模式图[4]
【精彩回顾】
Part I：Phase separation(LLPS) of Axin1 organizes the destruction complex
Axin1发生LLPS
在Axin1敲除的HEK293T细胞系（具备更高的Wnt基底信号）中，研究者表达携带EGFP标签的Axin1，可在共聚焦显微镜下观察到puncta（点状聚集）结构的形成（图二A），这与先前的报道一致。通过FRAP（光漂白-恢复）实验，他们检测到puncta内的Axin1蛋白的荧光信号能在1秒内恢复60%左右，而Wnt3a信号的存在会轻微降低恢复水平（图二 B）。此外，研究者还发现两个相遇碰撞的Axin puncta能相容合并成一个更大的球体，这表明活细胞中的Axin1 puncta是具备高度动态和液体状特性的（图二 C）。为了确认Axin1是否发生了LLPS，研究者纯化了携带MBP标签的Axin1蛋白，并于体外生理盐浓度下观察到了球状droplet的形成（图二 D），两个相遇的droplet同样能够融合（图二 E）。体内与体外一致的实验结果说明Axin1能够发生LLPS。
图二 Axin1在体内和体外形成的LLPS现象[2]
Axin1的IDR1区域对于LLPS的发生是必需的
为了具体探究Axin1的LLPS形成的机制并确认对于LLPS的产生至关重要的区域，研究者首先基于Axin1的氨基酸序列信息对蛋白质的各区域进行了无序性分析（图三 A），接着根据分析结果在Axin1敲除的HEK293T细胞中表达了一系列Axin1的缺失突变体（图三 B）。最终研究者发现IDR1缺失的突变体无法形成puncta，而IDR1区域保留的突变体仍能形成puncta（图三 C），说明IDR1对于puncta的形成很重要。研究者利用纯化的突变体蛋白质在体外观察到IDR1的缺失使得形成的droplet更少且尺寸更小（图三 D），上述结果共同证明了IDR1区域对于Axin1形成LLPS的必要性。
图三，IDR1区域对Axin1的LLPS性质的必要作用[2]
APC促进Axin1的LLPS
研究者在SW480细胞系（携带APC蛋白突变体）和HCT116细胞系（表达野生型APC）表达Axin1-EGP时发现，虽然二者中的Axin1都能形成puncta（图四 A），但是SW480细胞系中，Axin1 puncta在光漂白之后的荧光信号恢复速率明显慢于HCT116（图四 B），这暗示APC可能在增强Axin1聚集的动态性上发挥作用。由于人细胞的全长APC蛋白难以表达，研究者使用了同样能在哺乳动物细胞中抑制Wnt/β-cantenin信号通路的果蝇APC2（dAPC2）作为研究工具[6]。在野生型和Axin1敲除的HEK293T细胞中表达dAPC2均能形成puncta（图四 C），而在体外，MBP-dAPC2能形成droplet（图四 D），并且能与Axin1存在于同一droplet中（图四 E）。dAPC2和Axin1混合形成的droplet比任何单个蛋白形成的droplet都要大（图四 F），并且dAPC2增强了Axin1的内部流动性（图四 G）。上述证据说明APC独立于Axin1的自身的液相特性且低浓度的APC促进Axin1 droplet的形成。
图四，APC的液相特性及对Axin1 LLPS的促进作用[2]
Axin1作为支架蛋白装配destruction complex
Axin1敲除的HEK293T细胞系中，dAPC2作为puncta存在，GSK3β主要定位于胞质而CK1α和β-catenin主要在核中（图五 A）。但当这些蛋白分别和Axin1体内共表达时，除了CK1α仍在主要在核中，其他蛋白质均共定位在puncta（图五 B）。单独纯化的GSK3β，CK1α和β-catenin均不会在体外形成droplet（图五 C）。为确认Axin1在体外是否能招募destruction complex的其他组分进入该蛋白形成的droplet中，研究者将Axin1标记上绿色与其他标记上红色的蛋白提前混合后再诱导产生LLPS，他们观测到APC，CK1α，β-cantenin和GSK3β均与Axin1形成的droplet共定位（图五 D），当一个染料标记的蛋白质与其他四种未标记的蛋白质混合，在droplet均能观测到被标记的蛋白质（图五 E）。这些数据表明Axin1 缩合物可将 β-catenin，CK1α 和 GSK3β 募集到droplet。
图五，Axin1招募GSK3β，CK1α和β-catenin至其形成的droplet中[2]
Axin1的LLPS对β-catenin蛋白稳定性的调控
为进一步探究destruction complex的LLPS性质对调控β-catenin稳定性的作用，研究者们首先利用纯化的携带MBP标签的Axin1，GSK3β，CK1α，β-catenin和dAPC2蛋白质在体外重构destruction complex介导的β-catenin的磷酸化的过程。GSKβ介导的磷酸化水平在CK1α存在时能得到显著提升（图六 A），而Axin1的存在使其得到进一步增强（图六 B），但是CK1α介导的磷酸化不依赖于GSK3β和Axin1（图六 A，B）。dAPC2在体外也和Axin1一起协同增强介导的β-catenin的磷酸化，而对CK1α无显著影响（图六 B）。接着，研究者利用该体外体系验证了Axin1的一系列的纯化的缺失突变体蛋白质的功能，最终确认只有IDR1区域保留的突变体能够增强GSKβ介导的β-catenin的磷酸化（图六 C），这表明IDR1介导的Axin1的LLPS对于促进GSKβ介导的β-catenin的磷酸化是重要的。研究者们继续检测Axin1敲除的HEK293T细胞系中转染野生型Axin1和系列缺失突变体后β-catenin的表达水平，发现转染野生型Axin1和IDR1缺失的Axin1突变体的β-catenin的表达量明显高于其余突变体（图六 D），说明Axin1的LLPS对于β-catenin的降解过程也是重要的。
图六，Axin1的LLPS促进GSKβ介导的β-catenin的磷酸化并调控其降解过程
Axin1的LLPS对于Wnt/β-catenin的重要作用
研究者在Axin1敲除的HEK293T细胞中构建了TopFlash荧光素酶报告系统，以检测Wnt信号通路的激活水平。然后他们转染了野生型和系列缺失突变的Axin1蛋白后测定荧光素酶活性，当转染Axin1的IDR1缺失的各类突变体时，Axin1对于Wnt信号通路活性的抑制效应均存在不同程度的减弱（图七），这说明Axin1的LLPS对于Wnt信号通路起到了调节作用。
图七，Axin1敲除HEK293T细胞系Top-Flash荧光素酶报告系统在转染野生型Axin1和其突变体后，在Wnt3a存在与否的情况下的荧光素酶活性的测定[2]
小结1（图八）：
1.Axin产生LLPS，且该过程被APC推动
2.相分离的Axin1作为支架蛋白招募GSK3β，CK1α和β-catenin 并促进GSK3β介导的β-catenin的磷酸化从而促进其降解。
图八，Axin的LLPS功能的模式图
Part Ⅱ：Dvl LLPS promotes signalosome formation
内源Dvl可以形成puncta结构
早期已有研究证明当细胞内过表达Dvl2时，Dvl可以形成puncta结构，但是对于内源性的Dvl2是否也能在胞内形成puncta一直没有定论。在2007年，Richard P.Sear课题组提出蛋白Disshevelled能在活细胞中产生相分离[7]，但未提供实质性的证据。陈晔光院士课题组在HEK293T细胞系中，给内源Dvl的C末端带上了mEGFP标签，并利用GI-SIM（掠入射-结构光照明超高分辨率显微成像技术）[8]观察到了清晰的小puncta结构，在Wnt3a存在的情况下，会产生更多的puncta（图九 A）。研究者接着在Dvl1/2/3敲除的HEK293T细胞系中表达了两倍于内源蛋白水平的Dvl-EGFP，其形成的puncta相较于内源蛋白尺寸更大，且流动性更高（图九 B）。这些结果说明Dvl2在活细胞中形成了动态的缩合物结构。
图九，Dvl2在活细胞内形成puncta结构[5]
Dvl发生LLPS并受到受体Fzd5，LRP6和Axin1的促进
在观察到Dvl的LLPS后，研究者尝试探究该性质与signalosome组装的联系。研究策略与Part I相似，研究者利用缺失突变实验，确认了Dvl2的IDR1中的141-259氨基酸区域是对于puncta的形成最为重要的（图十 A），也获取了可用于后续实验的突变体蛋白。因为Wnt信号会刺激诱导Dvl和Fzd的相互作用[9]，他们首先测试Fzd5是否能促进Dvl2 droplet的形成。在体外droplet形成实验中，研究者发现在受体Fzd5（本身不具备相变性质[5]）存在的情况下，Dvl形成的droplet更多更大，且浊度提升（图十 B），说明Fzd5确实促进了Dvl的LLPS。因为Dvl2本身与细胞质膜关联，并为LRP和Axin的相互作用提供了平台从而帮助装配signalosome[10]，研究者使用纯化的Axin1和LPR6的胞内区添加至由Dvl2和Fzd5的胞内区形成的droplet中，在合适条件下，droplet的形成明显因Fzd5的胞内区、LPR6和Dvl受到促进，但Dvl（性质LLPS缺失）无法推动该过程（图十 C）。这些证据说明了Dvl2的LLPS对于组织droplet的形成是重要的。
图十，Dvl2的LLPS对于signalosome组分的相互作用提供了平台[5]
Dvl2的LLPS帮助其自身和Axin1招募到细胞质膜上
为了可视化Dvl2募集到细胞质膜上的受体复合物的过程，研究者使用多成像显微镜中的TIRF-SIM（全内反射结构光照明成像模式）[8]对Dvl2-mEGFP HEK293T细胞系进行成像分析。在Wnt3a的刺激下，Dvl2-EGFP形成了更多更大的质膜关联的puncta而Dvl2（dRE）-EGFP（LLPS缺失）却无法被招募到质膜上（图十一 A）。而对于Wnt3a刺激下Axin1的胞内观察发现，当Dvl2的LLPS缺失后，Axin1也无法有效地被招募到质膜上（图十一 B）。这些数据说明Dvl2的LLPS有助于signalosome的装配。
图十一，Dvl2和Axin1装配signalosome的可视化及Dvl2的LLPS对其本身和Axin1质膜招募的调控[5]
Dvl2的LLPS减弱Axin1的LLPS
由于早先的工作已报道Dvl2参与打散destruction complex的过程，而Axin1的LLPS又是作为该复合物支架蛋白性质基础，研究者尝试探究Dvl2是否对于Axin1的LLPS有调控作用以及Dvl2的LLPS是否参与调控。体外droplet形成实验发现，dAPC2促进Axin1的LLPS但Dvl2减少了Axin1 droplets的数量和大小，并且Dvl2会破坏dAPC2增强的Axin1的LLPS（图十二）。
图十二，Dvl2减弱由APC增强的Axin1的LLPS[5]
Dvl2调节Axin1的生物物理特性
由于Wnt3a的刺激并不影响胞质内的Axin1的内部流动性[2]，研究者尝试探究膜关联的Axin1和胞质内的Axin1是否存在不同之处。陈晔光团队通过TIRF成像观察在Wnt3a刺激与否的情况下，Axin-EGFP在敲除的HEK293T细胞系中质膜关联的puncta的形成情况。FRAP实验结果显示在Wnt3a刺激下，Axin1的流动性会显著增强（图十三 A）。研究者还检测了当Axin1与Dvl2以及Fzd5的胞内区和LRP6混合后的流动性变化，结果显示Dvl2的存在降低了Axin1的流动性，但在体外，Axin1与Dvl2、Fzd5的胞内区和LRP6混合后，Axin1的流动性反而上升了（图十三 B）。上述数据说明Axin1的流动性在质膜上的signalosome中，比起其自己在胞质内的形成相分离缩合物会更强。
图十三，Dvl2调节Axin1缩合物的生物物理特性[5]
Dvl2依赖其LLPS特性打散destruction complex并且对于Wnt信号通路是必需的
为探究Dvl2在体外是否参与打散destruction complex，研究者将Alexa Fluor488 NHSester标记的Axin1，dAPC2，GSK3β，CK1α和β-catenin与无Dvl2/野生型Dvl2/Dvl2（dRE）预混合后，再诱导相分离。Droplet的行程过程再加入Dvl2后明显受阻，形成的droplet也更少更小，Dvl2（dRE）虽然也减少了droplet的形成，但是效率大大降低（图十四 A）。研究者利用已搭建好的β-catenin体外磷酸化体系证明，Dvl2的加入会直接抑制GSK3β以及CK1α对β-catenin的磷酸化，而Dvl2（dRE）则无抑制效果（图十四 B），充分证明Dvl2的LLPS是打散destruction complex 是关键因素之一。TopFlash荧光素酶报告系统实验证据表明，Dvl2显著提高了Wnt3a诱导的荧光素酶的表达，而Dvl2的LLPS缺失的突变体则不具备这个效应（图十四 C），这说明Dvl2的LLPS特性对于介导Wnt/β-catenin至关重要。
小结2（图十五）：
1.内源Dvl2发生相分离，在快速积累到质膜后开启Axin1的招募
2.Dvl的LLPS对于介导signalosome缩合物的装配和破坏destruction complex的功能是重要的
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