投稿问答最小化  关闭

万维书刊APP下载

动物模型 | 脉络膜新生血管动物模型的构建

2023/4/4 11:39:31  阅读:106 发布者:

脉络膜新生血管(choroidal neovascularitionCNV)又名视网膜下新生血管,是来自正常脉络膜组织的增殖血管,可通过Bruch膜破损处进入Bruch膜与视网膜色素上皮层(retinal pigment epitheliumRPE)之间、视网膜神经上皮层与RPE之间、RPE与脉络膜之间。CNV是许多脉络膜视网膜疾病,如年龄相关性黄斑变性渗出期、高度近视黄斑变性等发生发展中的重要病理机制。为了进一步发现这些疾病确切的发病机理,制作接近临床特征的CNV动物模型是必要的前提。

目前,动物模型主要有3种,激光诱导动物模型、生长因子诱导的动物模型、基因缺陷动物模型。其中激光诱导的CNV模型应用最为广泛。

//

动物的选择

主要有鼠、兔和猴等。鼠是目前诱导CNV模型应用最广泛的实验动物。

鼠诱导CNV的发生率较高,大约有60%~70%在光凝后短时间(1周)内即可产生,而且光凝斑荧光渗漏1014天达到高峰,便于进行干预性研究;诱导CNV的条件也可标准化,价格相对便宜,便于基因操作,可用于观察单一基因过表达或低表达对CNV生成的影响。

不足之处是FFA中观察到的新生血管渗漏率低,仅为28%,且鼠的眼球较小,操作技术要求高。大鼠和小鼠CNV的诱发率无明显差异,小鼠眼球更小,操作要求更高,更适于进行有关基因敲除方面的研究。

实验性猴CNV模型与人类疾病改变极为相似,不仅组织学改变一致,在眼底荧光素血管造影(FFA)中也具有荧光素渗漏的特征。这种新生血管一般发生在激光光凝后4周,可持续252周。增生移行的RPE细胞包绕新生血管后,新生血管荧光素渗漏的表现会越来越不明显。

尽管这种模型得到了一致的认可,但动物来源受限,费用较高,CNV诱发时间较长,发生率低,限制了其应用。

兔产生的CNVFFA中不具有荧光素渗漏的特征,加之考虑到兔的眼底血循环结构与人类有较大的差异,目前已基本不用兔做此类模型。

//

造模方法

激光诱导动物模型

造模方法:

健康棕色挪威大鼠,雄性,体质量180-200g10%水合氯醛(0.35mL/100g体质量)腹腔注射麻醉。复方托吡卡胺滴眼液点眼散瞳。眼前放置滴加少量 1%甲基纤维素的盖玻片接触角膜,氪激光(波长647nm,光斑直径50um,功率360mW,曝光时间0.05s)距视盘2~3个视盘直径均匀光凝9个点,以见到有气泡产生提示Bruch膜被击穿为准。

FFA的观察:

光凝后第37142130d随机选取4只大鼠行FFA检查。散瞳及麻醉方法同前,10%荧光素钠注射液0.5mL/kg腹腔注射后立即行FFAFFA图像符合以下特点即认为CNV形成,①在造影早期即动脉前期或动脉期即显影。②与视网膜血管系统没有联系。③荧光素迅速渗漏,有一定的积存范围,后期形成高荧光区。将各时间段出现CNV光凝斑数目与该时间段的光凝斑总数的比值作为该时段的CNV发生率。

后续进行光镜观察、组织病理学CNV相对厚度测量、透射电镜观察。

优点:

激光诱导的CNV动物模型发生率较高,大约为 60%~70%,在光凝后短期时间(7d)内即可产生,而且激光斑的荧光素渗漏在 10~14d达到高峰,便于进行干预性研究;诱导CNV的条件也可标准化,价格相对便宜,是目前眼科诱导CNV最常用的动物模型。

生长因子诱导CNV模型

包括视网膜下注射载有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factorVEGF)基因的腺相关病毒载体、重组VEGF明胶微粒诱导CNV模型、视网膜下注射碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factorbFGF)凝胶微粒诱导兔CNV模型、视网膜下注射bFGF/脂多糖诱导兔CNV模型、脉络膜上腔植入bFGF微渗透泵诱导猪CNV模型等。其中视网膜下注射载有VEGF基因的腺相关病毒(adeno-associated virusAAV)载体诱导CNV模型是较为理想的模型。

造模方法1

2μl编码人 VEGF-A165腺病毒注射到大鼠视网膜下,CNV发生率为95%

造模方法2

在兔眼视网膜下注射5×106IU载有过表达VEGF-A165腺病毒载体诱导CNV模型,CNV发生率为83%

转基因或基因敲除诱导

转基因和基因敲除建立CNV模型是一种新兴技术,针对CNV发展的关键因素建立基因工程模型,可从不同角度分析各分子对CNV形成的影响,包括:(1VEGF164RPE65转基因小鼠;(2)双倍体(Tet/VMD2/VEGF)和三倍体(Tet/VMD2/VEGF/An2)转基因小鼠,视网膜可高表达VEGF,若同时视网膜下注射血管生成素2angiogenin2Ang2),能够100%形成CNV;(3)趋化因子CC类受体2chemokine CC motif receptor 2CCR2/趋化因子CC类配体2chemokine CC motif ligand 2CCL2)基因缺失诱导小鼠CNV模型,其成模率大约25%;(4)载脂蛋白E基因(apolipoprotein EApoE)过表达小鼠CNV模型是研究AMD病变中自发性CNV形成机制的重要模型;(5CCL2CX3C趋化因子受体1CX3C chemokine receptor 1CX3CR1)基因缺陷小鼠;(6)超氧化物歧化酶1superoxide dismutase 1SOD1)基因缺陷老化小鼠;(7)极低密度脂蛋白受体(very low density lipoprotein receptorVLDLR)定向突变小鼠;(8)视紫红质基因启动子/VEGF过表达小鼠。

优缺点:

转基因或基因敲除诱导的CNV模型具有诱导快,发生时间短等优点,与CNV病理生理学关联性强,对CNV发生机制的研究具有针对性,同时研究者可根据不同需求选择模型并修改参数;缺点有CNV诱导率低、面积小、价格贵等问题。

//

总结

在众多建立CNV模型的方法中,激光诱导CNV模型条件较成熟,研究历史久,可靠性高,应用广泛。由于动物体内环境不同于人体内环境,各种方法诱导的CNV动物模型也仅能模拟人类CNV,不能完全代替人类CNV发展的自然过程,因此,研究结果仅能为CNV发病和机制研究提供实验理论依据。

转自:MDL科研助手”微信公众号

如有侵权,请联系本站删除!


  • 万维QQ投稿交流群    招募志愿者

    版权所有 Copyright@2009-2015豫ICP证合字09037080号

     纯自助论文投稿平台    E-mail:eshukan@163.com