穿心莲内酯通过诱导自噬和抗肿瘤免疫反应抑制非小细胞肺癌进展
汇报人：研究生二年级 冯亚茹
近年来，非小细胞肺癌（NSCLC）在诊断和治疗策略方面取得了进展，但在预后方面仍然不能令人满意。穿心莲内酯（Andrographolide，AD）是从穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees中提取的一种二萜内酯，在体内和体外具有抗炎、抗HIV、抗流感病毒和抗癌等特性。目前穿心莲内酯用于非小细胞肺癌治疗的药理过程仍然未知。澳门科技大学姚小军、吴其标及梁丽娴教授团队针对穿心莲内酯抗非小细胞肺癌药理作用展开研究。该文章“Andrographolide suppresses non-small-cell lung cancer progression through induction of autophagy and antitumor immune response”于2022年3月发表于Pharmacological research杂志。
研究背景：
肺癌因其发病率高、死亡率高和预后差等被认为是世界第一大癌症。尽管近年来由于科技进步及技术创新，肺癌在诊断和治疗方面取得了很大进步，但患者仍未达到理想预后。自噬是真核细胞在自噬相关基因的调控下，利用溶酶体降解自身胞质蛋白和受损细胞器的过程，在癌症的发生发展中起着动态的抑制或促进作用。作为细胞中一种自我降解的正常生理过程，自噬通过清除错误折叠的蛋白质、受损的细胞器和活性氧（ROS），抑制慢性组织损伤，进而防止肿瘤的发生，特别是在肿瘤发生的早期[1]。而在肿瘤进展晚期，受到血管生成限制、营养缺乏和缺氧等环境压力的影响，自噬降解细胞内容物和大分子物质并被自身循环利用，有助于肿瘤的生存和生长，并通过促进转移来增强肿瘤的侵袭性。因此，自噬在癌症治疗中的特殊作用可能高度依赖于环境和细胞类型[2]。自噬对调节癌症免疫反应的作用越来越受到关注，一些天然分子可以通过调节自噬途径抑制癌细胞增殖，降低细胞耐药性。
肿瘤免疫治疗是通过主动或被动的方法使机体产生肿瘤特异性免疫应答来发挥其抑制和杀伤肿瘤作用。其中，以PD-1/PD-L1抗体为代表的免疫检查点抑制剂通过抑制肿瘤细胞免疫检查点活性，释放免疫刹车，激活杀伤T细胞对肿瘤的免疫应答效应，从而达到抗肿瘤的作用。最近的临床证据表明，这些抑制剂通过多种机制调节肿瘤微环境以发挥抗癌作用[3]。
在这项研究中，作者通过Lewis肺癌小鼠模型和H1975异种移植瘤裸鼠模型研究穿心莲内酯的抗NSCLC作用，并通过体外细胞模型探究其作用机制，发现穿心莲内酯可能通过诱导自噬和抑制PD-L1来抑制NSCLC进展。
图1 AD对NSCLC的抑癌机制示意图。AD治疗诱导ROS的产生，进而抑制JAK2/STAT3信号并通过p62的累积减少PD-L1的表达。AD还直接作用于STAT3，抑制其磷酸化以减少PD-L1的产生，并增加CD8+T细胞的浸润和功能，显著减少Treg细胞以抑制肿瘤生长。
研究背景：
Result 1 AD显著抑制NSCLC细胞系H1299和H1975的增殖并诱导其凋亡
图2A展示了AD的化学结构。该研究首先考察AD对非小细胞肺癌的细胞毒作用。用不同浓度的AD处理H1975、H1299、H1650和H460 4种NSCLC细胞株，发现AD能有效抑制NSCLC的增殖，并呈剂量依赖关系 (图2B)。图2C总结了AD在所有细胞系中的IC50值，其中H1975和H1299细胞对AD较为敏感，而AD在正常肺支气管上皮BEAS-2B细胞系中相对安全，细胞毒性较小。为了探讨AD对H1975和H1299细胞的凋亡作用，作者用AD处理H1975和H1299细胞24小时，凋亡细胞比例如图2D-G所示，细胞凋亡率随给药浓度增加而增加。综上所述，AD在体外能有效抑制H1975和H1299细胞的生长，增加细胞凋亡率。
图2 AD在不同的非小细胞肺癌细胞系和正常肺成纤维细胞系中表现出不同程度的敏感性。(A) AD的结构。(B) 不同浓度的AD处理NSCLC细胞72h后，用MTT法检测细胞存活率。(C) 4株NSCLC细胞和BEAS-2B细胞经AD作用72 h后的IC50值。(D-G) H1975和H1299细胞经AD作用24 h后，用流式细胞仪分析细胞凋亡率。Mean ± S.D., *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。
Result 2 AD诱导人非小细胞肺癌细胞系p62介导的选择性自噬形成
自噬是一把双刃剑，既可以促进又可以抑制癌症。肿瘤微环境中不同的应激信号会改变免疫细胞和肿瘤细胞中的自噬途径，从而对肿瘤增殖、免疫和治疗产生不同的影响。接下来作者检测了H1299和H1975细胞中与自噬相关的LC3、p62和ATG5蛋白。结果显示AD可上调H1299和H1975细胞中LC3B的蛋白水平，LC3B是一种广泛使用的自噬标志物，提示AD可诱导NSCLC细胞自噬（图3A-B）。SQSTM1/p62是自噬相关蛋白 LC3 和多聚泛素化蛋白之间的桥梁，将受损蛋白、线粒体和入侵细菌转运到自噬体中，并通过泛素信号通路降解它们，在AD处理后，p62表达上升（图3A-B）。为了进一步探讨AD在NSCLC细胞自噬中的作用，作者用自噬早期抑制剂3-methyladenine (3-MA)和晚期抑制剂chloroquine (CQ)、bafilomycin A1 (BAF-1) 来评估自噬流。AD和3-MA共同处理消除了AD对LC3B蓄积的影响（图.3C-D）。与AD单独处理相比，AD和CQ或BAF-1联合处理增加了LC3B水平（图3E-F）。并且AD通过抑制自噬的形成或阻断自噬的溶解来增加p62的表达（图3G-H）。因此，作者认为AD可以诱导NSCLC细胞中p62介导的选择性自噬的形成。
图3 AD诱导人非小细胞肺癌细胞系p62介导的选择性自噬形成。(A-B) 用AD处理H1975和H1299细胞24 h后，用Western印迹法检测细胞中LC3B、p62、ATG5的表达。(C-H) 用AD联合自噬抑制剂3-MA、CQ或BaF-1处理细胞，用Western blot法检测LC3B、p62的表达。
Result 3 AD对非小细胞肺癌细胞PD-L1水平的调节
p62也是免疫调节剂，有研究对接受抗 PD-1（nivolumab）单药治疗的NSCLC患者进行活检分析，发现p62和PD-L1之间存在很强的负相关性。p62介导的选择性自噬可导致更强的先天免疫反应[4]。因此作者研究了AD对H1975和H1299细胞中PD-L1的影响，发现经AD处理后，H1975和H1299细胞PD-L1的蛋白和mRNA表达均受到显著抑制（图4A-D）。临床研究还表明，一些炎症因子，如IFN-γ，可以调节肿瘤微环境，使癌细胞逃避免疫细胞的破坏[5]。在本研究中，作者利用IFN-γ分析了AD对PD-L1表达的影响。AD可降低IFN-γ诱导的PD-L1水平（图4E-F），并显著减弱IFN-γ诱导的H1299和H1975细胞表面PD-L1的表达（图4G-J）。自噬调节PD-1及其配体PD-L1在许多类型的癌症中已被报道。自噬抑制消除了AD引起的PD-L1下调（图4K-L）。同时，3-MA和CQ显著增加了NSCLC细胞表面PD-L1的表达，这种作用在AD处理后显著减弱（图4M-P）。因此，AD可能通过调节NSCLC细胞的自噬来抑制PD-L1的表达，控制PD-L1的降解。
图4 AD降低非小细胞肺癌细胞中PD-L1的表达。(A-B) AD处理H1975和H1299细胞24 h后，采用Western blot法检测PD-L1的表达。(C-D) qRT-PCR检测PD-L1的mRNA表达。(E-F) Western Blott法检测PD-L1、STAT3、P-STAT3的表达。(G-J) H1975和H1299细胞经DMSO和AD处理1h后加入IFN-γ作用24 h，使用流式细胞仪检测细胞表面PD-L1的表达。(K-L) 细胞经3-MA、CQ、AD单独处理或3-MA+AD、CQ+AD联合处理后，Western blot法检测PD-L1、STAT3、P-STAT3的表达。(M-P) H1975和H1299细胞用DMSO和AD处理1h，再用CQ或3-MA处理24 h，用流式细胞仪检测细胞表面PD-L1的表达。Mean ± S.D., *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
Result 4 AD通过STAT3信号通路抑制NSCLC细胞的增殖
在NSCLC细胞中，已发现明显的STAT3激活。由选择性剪切由选择性剪接产生的两种 STAT3亚型（α/p92 和 β/p83）以4:1的比例存在于大多数细胞类型中。有研究显示，STAT3β 水平与pSTAT3(Tyr 705)水平呈正相关。并且H1975和H1299细胞的STAT3β蛋白和pSTAT3水平高于其他NSCLC细胞。因此，作者考察了AD对H1975和H1299细胞中STAT3的影响，发现AD处理后可以降低STAT磷酸化，并呈剂量依赖性特点（图5D-E）。为了进一步研究AD与STAT3的作用方式，作者采用分子对接技术来确认AD是否可以与STAT3以相对较高的亲和力结合。如图5A所示，AD与残基VAL637、SER611和SER613形成氢键。AD与配体能够对接到STAT3的疏水结合口袋中，对接分数分别为-5.33 ± 0.19 kcal/mol和-12.03 ± 0.25 kcal/mol。同时，作者使用STAT3抑制剂Statti作为阳性对照，其对接得分为-1.65±0.21 kcal/mol。因此，上述结果表明AD可以与STAT3结合。之后，作者又使用过表达STAT3的细胞来考察AD的作用，通过流式细胞术发现过表达STAT3的H1975与H1299细胞中PD-L1显著升高，并且经AD处理后，PD-L1表达降低（图5 F-I）。通过western blot也发现，在过表达STAT3的细胞中，PD-L1的表达增加，AD处理后，PD-L1表达降低，而p62的表达显著降低（图5 J-K）。越来越多的证据表明，IFN-γ-JAK-STAT 信号通路通过激活一些与PD-L1基因启动子区域结合的重要转录因子，在转录水平上调节PD-L1的表达 [6,7]。因此，AD可能通过调节STAT3来控制非小细胞肺癌中PD-L1的降解。
图5 AD通过STAT3信号通路抑制非小细胞肺癌细胞的生长。(A) AD与STAT3的3D结构。(B) STAT3的疏水区以及AD与STAT3的关键残基之间的相互作用。(C) AD与STAT3的结合口袋。(D-E) AD处理H1975和H1299细胞24 h后，用Western blot法检测P-STAT3、T-STAT3的表达。(F-I) 过表达STAT3的H1975和H1299细胞经DMSO和AD处理24 h后，用流式细胞仪检测细胞表面PD-L1的表达。(J-K) AD处理过表达STAT3的H1975和H1299细胞24 h后，用Western blot法检测PD-L1、T-STAT3、P-STAT3、p62和LC3B的表达。Mean ± S.D., *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。
Result 5 AD通过诱导氧化应激增加NSCLC细胞自噬诱导的细胞死亡
氧化应激与自噬之间有很强的相关性，ROS是癌细胞中细胞死亡和自噬的常见媒介[8]。基于此，作者考察了AD对细胞ROS水平的影响，由图6A-B可知，AD治疗后NSCLC细胞内ROS水平升高。之后作者又用ROS清除剂NAC进一步验证ROS在AD处理中的作用。NAC可显著逆转AD诱导的细胞凋亡(图6E-H)。NAC可显著逆转AD诱导的STAT3去磷酸化，阻止AD诱导的LC3-II/LC3-I表达增加，并下调PD-L1水平，同时减少p62的表达（图6I-J）。STAT3 是一种氧化还原敏感的转录因子，在被 JAK 激活后调节自噬，有研究发现，ROS的产生是可以引起卵巢癌细胞中JAK2/STAT3通路失活。因此，AD产生的ROS抑制NSCLC中的JAK2-STAT3通路，导致p62的积累来调节PD-L1，从而诱导NSCLC细胞死亡。
图6 AD通过诱导氧化应激来增强自噬诱导的NSCLC细胞死亡。(A-D) 流式细胞术分析H1975和H1299细胞的ROS水平。(E-H) H1975和H1299细胞与NAC预先孵育1h后，再用AD处理24 h，用流式细胞仪检测H1975和H1299细胞的凋亡率。(I-J) H1975和H1299细胞与NAC预先孵育1h，然后用AD处理24h。Western blot法检测P-STAT3、T-STAT3、PD-L1、p62和LC3B的表达。Mean ± S.D., *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。
Result 6 AD延长Lewis肺癌小鼠和H1975异种移植瘤模型小鼠的生存期并抑制肿瘤生长
作者用C57BL/6J小鼠建立Lewis肺癌模型，观察AD的体内药效。首先，AD治疗延长了小鼠的存活时间（图7A）。与对照组相比，AD组小鼠体重无明显变化（图7B），AD治疗组肿瘤生长减慢，其中中剂量和高剂量组肿瘤体积和质量明显低于对照组（图7C-D）。另外作者还建立了荷瘤Balb/c裸鼠模型。AD处理组小鼠的体重与未处理组小鼠的体重没有差异（图7F），且AD治疗组肿瘤体积和质量也明显小于对照组，高剂量治疗效果明显优于低剂量组（图7G-I）。
图7 穿心莲内酯抑制H1975异种移植瘤裸鼠肿瘤生长，并提高Lewis肺癌模型小鼠的存活率。(A) 检测Lewis肺癌模型小鼠的存活率。(B) AD处理不影响小鼠的体重。(C) 治疗过程中肿瘤体积 (D-E)Lewis肺癌模型小鼠的肿瘤及重量。(F-I) AD在H1975异种移植瘤裸鼠中的体内药效。Mean ± S.D., *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。
Result 7 AD增强抗PD-1单抗免疫治疗的抗肿瘤作用
免疫联合疗法是目前抗癌的主要方向。使用针对PD-1或PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1通路可以增强抗肿瘤免疫活性并抑制肿瘤增殖，然而，某些癌细胞的低反应率仍然是PD-1、PD-L1单抗应用所面临的挑战。作者将AD与PD-1单抗联合给药，观察AD对PD-1抗癌治疗作用的影响。AD和PD-1单抗的联合治疗没有改变小鼠的体重（图8A）。在小鼠模型中，单独使用PD-1单抗并不能有效地阻止肿瘤的生长，但AD显著增强了抗PD-1单抗免疫治疗的抗肿瘤效果，并减少了肿瘤的重量和大小（图8B-D）。AD和PD-1单抗联合治疗NSCLC可显著降低小鼠PD-L1的蛋白和RNA表达（图8E-F）。免疫组化结果显示联合应用AD和PD-1单抗可抑制肿瘤细胞Ki67的表达，降低PD-L1的表达（图8G）。联合用药也显著增加了肿瘤浸润性CD8+T细胞的数量，表现出更大的激活表型，并产生了更多的IFN-γ、granzyme B和TNF-α（图8H-N）。
图8 AD与PD-1单抗联合应用可增强抗肿瘤效果。(A-D) Lewis肺癌模型小鼠体重、肿瘤体积、肿瘤重量变化。(E) Western blot法检测肿瘤组织中PD-L1的表达。(F) qRT-PCR方法检测肿瘤组织中PD-L1 mRNA的表达。(G) 免疫组织化学法检测Lewis肺癌肿瘤组织中Ki67和PD-L1的表达。(H-J) 采用流式细胞术对不同组别的肿瘤标本进行CD+4、CD+8、IFN-γ、TNF-α、granzyme B和FOXP3抗体检测。Mean ± S.D., *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。
总结与思考
在本研究中，作者发现AD可以调节NSCLC细胞自噬和PD-L1表达。分子动力学模拟表明，AD与STAT3有高亲和力。AD通过抑制STAT3磷酸化来调节PD-L1的pP62依赖性选择性自噬降解。体内研究表明，AD可以抑制H1975细胞异种移植瘤小鼠和Lewis肺癌细胞模型小鼠中的肿瘤生长，并且在较高浓度下获得更好的疗效。AD通过增加CD8+T细胞浸润，增强了PD-1单抗免疫疗法的疗效，延长小鼠存活时间。这项研究阐明了AD抑制NSCLC的具体机制，AD和抗PD-1单抗免疫疗法联合治疗可能是治疗NSCLC的一种新策略。
近年来很多研究验证了中药在抑制肿瘤发生发展、改善患者预后等方面的良好效果。中医对于肿瘤的形成存在阴阳平和和正邪相争等理论，这与肿瘤免疫治疗的观点不谋而合。目前许多研究也发现了多种方剂及中药单体具有调节肿瘤免疫的作用，其治疗法则多为扶正祛邪，通过扶正类中药如人参、黄芪等来增强机体免疫，促进淋巴细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞活化及细胞因子分泌；通过清热解毒或活血化瘀类中药，抑制T细胞增殖、减少炎症因子释放，实现祛邪功效。近几年也发现很多针对PD-1/PD-L1的中药单体
成分如小檗碱、双氢青蒿素、连翘酯苷A等。从肿瘤免疫角度出发，未来或许能更清楚地解
释中医药治疗肿瘤的机制，挖掘出更多肿瘤免疫药物。
参考文献
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原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1043661822001438
DOI: 10.1016/j.phrs.2022.106198
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