麻省总医院：僵硬限制了肠干细胞的干细胞性，并使其向杯状细胞分化

背景

肠干细胞 (ISCs)从隐窝底部持续迁移到绒毛尖端的软基底膜 (BM)上，分化为多种类型的肠上皮细胞，包括杯状细胞、肠内分泌细胞 (EECs)、簇状细胞、微褶 (M)细胞和肠上皮细胞。炎症性肠病 (IBD)包括溃疡性结肠炎 (UC)和克罗恩病 (CD)，与肠上皮的恶化相关，包括屏障功能丧失和各种上皮细胞群的改变。与此同时，细胞外基质 (ECM)蛋白的过度沉积，如I型和IV型胶原蛋白，导致软基底膜硬化。研究表明，组织僵硬度可以调控间充质干细胞、中枢神经系统祖细胞和胰腺的分化。         

简介

2023年3月3日，来自美国麻省总医院的Shijie He及其团队在Gastroenterology (IF: 33.883)杂志上发表名为Stiffness Restricts the Stemness of the Intestinal Stem Cells and Skews Their Differentiation Towards Goblet Cells的研究[1]。

主要结果

在软水凝胶基质上培养的肠道类器官

为了更好地理解硬度如何影响ISC的命运，我们在刚度可调的聚丙烯酰胺-水凝胶基质的顶表面培养肠道类器官 (图1A)。虽然这个平台如实地再现了肠上皮的解剖结构，而肠上皮本质上是位于BM顶部表面的单层上皮细胞，它也允许对僵硬度进行单独操作。一个类似的系统最近被用于研究促进隐窝细胞向上迁移的基本机制。从小鼠小肠中获取ISCs和隐窝，并接种在水凝胶基质上。采用Lgr5-EGFP-IRES-creERT2小鼠追踪LGR5+ ISCs。随着类器官的生长，软水凝胶表面弯曲 (0.6 kPa，与健康BM的表面匹配)，形成一个2.5D曲面，模拟体内隐窝的内陷 (图1B)。E-cadherin染色显示表达集中在顶端表面，提示上皮极性的建立 (图1C)。隐窝样区域密集分布着ISCs，其中混杂着大的、光学暗的UEA+潘氏细胞 (图1D)。KI-67在LGR5高表达的ISCs中也呈弱表达，而在LGR5高表达的ISCs中KI-67也呈弱表达。绒毛样区域主要由VILLIN+肠细胞构成 (图1D)，成熟MUC2+杯状细胞 (图1E)和嗜铬粒蛋白-A+ (CHRO-A) EECs的数量显著较低，这与体内小肠上皮的组成一致。此外，活细胞成像显示，绒毛样区域的细胞周转率约为3-4天 (图1F，在图1G中量化的绒毛区域面积)，与体内观察到的情况相同。为了确定BM刚度如何影响ISCs的干性和分化轨迹，我们在不同硬度的水凝胶基质上培养了2.5D的肠类器官。

ISCs及其分化子代硬度调控的转录特征

为了提供在转录水平上硬度如何影响ISCs及其分化后代的综合图谱，我们进行了单细胞RNA测序 (scRNAseq)分析。我们的2.5D肠道类器官的单细胞表达谱被聚成13个细胞组 (图5A)。根据主成分的统计学显著性选取30个主成分进行降维。使用已知的上皮标记基因25进行聚类注释揭示，体外系统中存在所有不同类型的祖细胞和分化的肠上皮细胞 (图5A, 5B)。使用基于分区的图抽象 (PAGA)进行轨迹推断，展示了从干细胞和TA细胞到祖细胞再到分化细胞群的轨迹。无论是在软硬条件下，生物三重样本的聚类一致IEGCs同时表达轻度水平的干性、肠细胞和杯状细胞的标记基因 (图5B)。SC比例测试分析也证实了硬度对ISC分化轨迹的影响，包括ISC和簇细胞分别减少25%和42% (图5C)。杯状细胞、M细胞和上皮样细胞分别增加28%、24%和25%。差异表达分析和免疫荧光成像显示，另一种杯状细胞标志物三叶因子3 (Tff3)在硬基质上的整个绒毛区域广泛表达 (图5D)。

人体IBD患者的硬度诱导的ISC分化轨迹

为了确定硬度诱导的肠道类器官和鼠肠上皮重塑与人类IBD患者的相似程度，我们分析了从IBD患者和健康个体的结肠切除样本产生的scRNAseq数据。人类单细胞图谱被聚类成10个上皮细胞亚群，这些细胞亚群使用已知的标记基因进行注释。IBD与患者的ISC和肠细胞群减少，以及杯状细胞增加相关 (图7A，分别考虑样本量和不考虑样本量的情况下)，这与体外观察到的基质硬化表型一致。通路富集分析表明，IBD中参与ECM生物合成 (包括I型胶原和IV型胶原)的通路被强烈激活，这表明纤维化和硬度增加 (图7A)。与此同时，IBD患者的ISC人群中WNT信号受到抑制 (图7A)。此外，在UC患者的ISCs和杯状细胞中，包括INTEGRIN、YAP和TEAD (YAP的主要转录因子)在内的机械信号通路均有强效激活，但在肠上皮细胞中没有。与这一观察结果一致，已建立的YAP上调基因在IBD结肠的ISC和杯状细胞群中均富集 (图7A)。与体外类器官相比，人类IBD和健康样本的scRNAseq分析发现了相似的关键特征。最显著的是，IBD患者的ISCs数量减少，杯状细胞增加。此外，YAP信号通路在ISCs中表达上调，Wnt信号通路被抑制。

结论及展望

综上所述，我们的研究结果强调了基质硬度可以有效地调控ISCs的干性及其分化轨迹，支持纤维化诱导的肠道硬度在IBD的上皮重塑中起直接作用的假设。

原文链接

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0016508523002159?via%3Dihub

参考文献

1.He Shijie,Lei Peng,Kang Wenying et al. Stiffness Restricts the Stemness of the Intestinal Stem Cells and Skews Their Differentiation Towards Goblet Cells.[J] .Gastroenterology, 2023, undefined: undefined.

转自：“生物医学科研之家”微信公众号

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