以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者Nanozymes
01
研究背景
作为新一代人工模拟酶，纳米酶凭借其高稳定性、高催化效率和活性易于调节等优点为诸多疾病带来了治疗突破。近年来，随着炎症性肠病 (IBD)潜在机制的不断揭示，纳米酶在IBD治疗中的潜力引发了广泛的关注。IBD是一种慢性、特发性肠道炎症性疾病，对世界卫生系统造成巨大社会和经济负担[1]。IBD 与免疫失调、肠道微生物、炎症和氧化应激有关，并且这些因素相互干扰，形成异常复杂的关系，这使得IBD治疗变得异常困难[2]。最近许多新的临床和实验证据表明，过量的活性氧 (ROS) 在IBD病变部位主导并加剧了 IBD 的进展。ROS不仅直接破坏肠道微绒毛，还介导ROS与炎症之间的恶性循环，引起病理性炎症反应。此外，ROS 为厌氧呼吸提供末端电子并支持兼性厌氧菌的增殖，最终导致肠道微生物失调[3]。基于以上病理特征，设计和开发用于治疗 IBD 的口服抗氧化纳米酶成为研究热点[4]。 然而，已开发出的多种金属基纳米酶在体内易在消化道内分解失活，且在长病程给药下不可避免地会释放出金属离子被人体吸收，带来长期毒性风险。
因此，中南大学湘雅医院黄琼副教授、吴畏教授团队和中南大学药学院艾可龙教授团队开发了一种简便的方法来制备具有消除多种 ROS 能力的无金属黑色素纳米酶(MeNPs)。该研究首次揭示无金属黑色素纳米酶具有优异的胃肠道稳定性和生物相容性，可以通过自然靶向肠炎部位消除 ROS 来有效治疗 IBD 。作者还深入系统地揭示了MeNPs的治疗机制：MeNPs通过缓解氧化应激、降低内质网应激、减少肠上皮细胞凋亡、减少炎症细胞浸润、恢复肠道屏障，调节肠道菌群最终实现有效治疗IBD。研究成果可能为 IBD 和其他炎症性疾病的纳米酶抗氧化疗法提供有价值的指导。相关研究成果以“Oral Metal-free Melanin Nanozymes for Natural and Durable Targeted Treatment of Inflammatory Bowel Disease (IBD)”为题，发表于国际顶级期刊《Small》上。
图 1 口服 MeNPs 治疗 IBD 的示意图。(A) MeNPs 具有很强的胃肠道稳定性和自然靶向性，可以高效、准确地到达病灶。(B) MeNPs 减轻了 IBD 的6大病理特征：氧化应激、内质网应激、细胞凋亡、炎症反应、肠道屏障受损和肠道菌群紊乱。
02
研究内容
1、MeNPs的合成与表征
首先，作者以类Stöber 方法合成了MeNPs。如图 2B中透射电子显微镜 (TEM) 所示，MeNPs 具有单分散球形结构，平均直径约为 120 nm。如图2C所示X 射线光电子能谱证实了MeNPs中含有丰富的羟基、亚胺等基团，还存在丰富的未配对电子（图 2D），赋予了 MeNPs 清除多种 ROS 的强大能力。用模拟消化液处理后（SDF-MeNPs），C1s、O1s和N1s的峰仍然存在，表明MeNPs在消化道中保持了稳定的化学结构。MeNPs 和 SDF-MeNPs 的 Zeta 电位分别为 -30.8 和 -29.4 mV（图 2E）。且MeNPs 和 SDF-MeNPs都具有高效的ROS清除能力 （图 2F-I）。
图 2 MeNPs 的合成和表征。 (A) 用于治疗 IBD的口服靶向 MeNPs 示意图。 (B) MeNPs的 TEM 图像以及 MeNPs（蓝星）和 SDF-MeNPs（橙星）的照片。 (C) MeNPs 和 SDF-MeNPs 的 XPS C1s 光谱。 (D) MeNPs 和 SDF-MeNPs 的EPR 光谱和 (E) Zeta 电位分布强度。 (F) MeNPs 的 O2·− 清除能力。(G) MeNPs 和 SDF-MeNPs 的 类SOD 酶活性。 MeNPs 和SDF-MeNPs 的 (H) H2O2 和 (I) ONOO−清除能力的比较。
2、MeNPs减少HT-29细胞内IBD诱导因子
MeNPs处理后DCFH-DA探针和MitoSOX探针荧光信号显著降低，表明MeNPs在体外表现出优异的ROS消除能力（图3A-C）。如图 3D&E 所示，MeNPs有效地恢复了 HT-29 细胞中的线粒体膜电位，表明 MeNPs减轻了线粒体内膜损伤。细胞凋亡是IBD中ROS对肠细胞造成的主要继发性损伤。如图 3F-H 所示，MeNPs 显著减轻了 H2O2刺激诱导的 HT-29 细胞凋亡。相应地，HT-29 细胞中 Bax 的表达减少且Bcl-2的水平增加（图 3I-K）。
图 3 MeNPs 在 HT-29 细胞层面缓解 IBD 的作用。 (A) HT-29 细胞在不同处理条件下的 DCFH-DA（ROS 探针）染色（绿色）和 Hoechst 染色（蓝色）合并图像和 (B)流式细胞术结果。(C) HT-29 细胞的 MitoSOX 染色（红色）和 DAPI 染色（蓝色）合并图像。(D) HT-29 细胞中 JC-1 的免疫荧光染色和 (E)定量。(F) PI 阳性HT-29死细胞的定量。(G) HT-29细胞在不同处理条件下的Annexin V-FITC/PI流式细胞术结果和(H)凋亡细胞比例的定量统计结果。(I)不同处理条件下HT-29细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的Western blot分析。(J) Bcl-2 和 (K) Bax 的WB定量。
作者还用MeNPs 处理脂多糖 (LPS) 刺激的活化 M1 巨噬细胞（RAW264.7 细胞）以检测其对炎症的影响。诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 作为 M1 巨噬细胞的表面标志物，产生大量活性氮 (RNS)，导致线粒体氧化磷酸化功能破坏，释放大量 ROS。如图 4B所示，MeNPs 显著降低 LPS 诱导的巨噬细胞激活并下调RAW264.7 细胞中 iNOS 的表达。此外，MeNPs 还下调了 COX-2 表达（图 4C），降低细胞内ROS和RNS水平（图 4D&E）。最后，与 COX-2 表达的显著降低一致（图 4F-G），MeNPs 处理后炎症因子（IL-6，TNF-α）降低，炎症抑制因子（IL-10）增加（图 3H-J）。
图4 MeNPs在RAW264.7细胞中的抗炎作用。 (A) MeNPs 打破 ROS-炎症恶性循环的示意图。(B) 每组 RAW264.7 细胞中iNOS（蓝色）、DAPI（绿色）及合并图像的免疫荧光染色。(C) 每组 RAW264.7 细胞中 β-肌动蛋白（绿色）、COX-2（红色）、DAPI（蓝色）及合并图像的免疫荧光染色。(D) 每组 RAW264.7 细胞ROS 和 (E) RNS 生产率。(F) 不同处理条件下 RAW 264.7 细胞中 COX-2 蛋白表达WB分析和 (G)定量。(H-I) 每组 RAW264.7 细胞的 TNF-α、IL-6 和 IL-10 产生量。
3、MeNPs在IBD中的分布及治疗作用
MeNPs能否准确到达IBD病灶部位是保证治疗效果的关键。口服给药组MeNPs沿消化道到达结肠部位，在其他器官中几乎没有分布（图 5C）。并仅在IBD小鼠肠道中病变的位置较长时间蓄积，而不停留在健康的肠管内（图 5D-E）。如图 5F 所示，MeNPs 穿过受损的肠上皮屏障，到达被免疫细胞严重浸润的固有层，而在心、肝、肺等器官中极少蓄积（图 5G），并在结肠炎病变部位持续存在较长时间（图 5H）。DSS诱导的结肠炎小鼠表现出体重减轻、大便隐血、结肠组织损伤的病理特征，口服MeNPs可以显著改善IBD的症状和体征，且效果优于50mg/kg的对照药物5-ASA（图 5I-K）。
图 5 MeNPs 在 IBD 中的分布和治疗效果。 (A) 结肠炎小鼠的建立和治疗计划的示意图。(B) FTIC-MeNPs 的合成：FTIC 对胺化 MeNPs 的修饰。(C) 口服和 (D) 静脉内给药的 MeNPs 的体内分布荧光。(E) 左图：MeNPs 在结肠炎和健康部位的体视荧光。中：结肠炎和健康部位结肠切片的荧光，右：结肠炎和健康部位结肠切片的 H&E 染色结果（红色：结肠炎；蓝色：健康）。(F) MeNPs 处理的结肠炎小鼠结肠组织微观结构的 TEM 图像。(G) 体内分布荧光强度的量化。(H) MeNPs 在体内的时间消除曲线。(I) 14天内 DAI评分。(J)不同处理的小鼠的结肠外观（上）和结肠长度（下）。(K) 每组 H&E 染色结肠切片的代表性图像。
4、MeNPs治疗机制的转录组学分析
韦恩图揭示了健康组、结肠炎模型组和MeNPs治疗组之间存在显著不同的转录组谱（图6A）。火山图显示，MeNPs处理后，323个基因上调，2122个基因下调（图6B）。GO富集分析表明，在结肠炎模型组和 MeNPs 治疗组之间氧化应激的反应、一氧化氮合酶 (NOS) 活性、白细胞介素 (IL)-6、IL-10 的调节 和肿瘤坏死因子 (TNF) -α 的产生、细胞凋亡过程、对 ER 应激的反应和 ER 未折叠蛋白反应有表达差异（图6C）。通过KEGG通路富集分析显示，在结肠炎模型组和MeNPs 治疗组之间与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和肠道感染高度相关的7条生物通路存在显著差异（图6D-E）。
图 6 MeNPs 处理 DSS 诱导的结肠炎的转录组学分析。 (A) 全转录组 RNA-seq 分析的韦恩图。(B) 结肠炎组和 MeNPs 处理组之间差异表达基因的火山图（灰色：无显著差异；绿色：log2FC>2；蓝色：P 值<0.05；红色：log2FC>2 且 P 值< 0.05）。(C) GO 生物过程聚类分析和 (D) KEGG 通路富集分析结肠炎组与 MeNPs 治疗组差异基因。(E) 6个功能类别中差异表达基因的热图。
5、MeNPs缓解氧化应激和内质网应激
MeNPs能提升结肠组织中SOD酶活性，降低MPO活性和MDA含量（图7A-C），并缓解线粒体损伤（图7D），进而避免线粒体内膜细胞色素c (Cyt c)泄露触发细胞凋亡（图7E）。此外，MeNPs治疗后ER形态恢复，特征结构明显（图7F-H）。如图7I-L所示，MeNPs 治疗后ER 应激的主要通路基因[蛋白激酶 R 样内质网激酶 (PERK)、真核起始因子 2 (eIF2α)、激活转录因子 4 (ATF4)和C/BEP 同源蛋白(CHOP)]表达均降低。
图 7 MeNPs 减轻氧化应激和内质网应激。 (A-C) 在每组的结肠组织匀浆中测量的 MDA、MPO 和 SOD 水平。(D) 每组的 Cyt c 的免疫组化染色。(E) Cyt c 阳性率的量化。(F-H) 健康小鼠、结肠炎小鼠、和口服 MeNPs后结肠炎小鼠的内质网的TEM 图像。(I-L) 每组结肠组织匀浆中 PERK、eIF-2α、ATF4 和 CHOP 的 mRNA 水平。
6、MeNPs减少细胞凋亡和炎症反应
如图 8A-B 所示，MeNPs 处理组的TUNEL 绿色荧光强度大大降低，表明MeNPs显著减少了结肠炎小鼠结肠区域的细胞凋亡。图8C-F中核因子红细胞 2 相关因子 2（Nrf2，一种抗氧化应激的调节因子）和 Bcl-2 的表达上调和Bax的下调了进一步佐证了MeNPs的抗凋亡能力。异常和持续的上皮过度增殖导致肠增生和息肉的发展，甚至可能介导 IBD 诱发的结直肠癌。图8G-H中Ki-67免疫组化结果表明MeNPs能缓解结肠组织中的异常增殖。MeNPs可以降低组织炎症因子（IL-6、TNF-α）水平，增加炎症抑制因子（IL-10）分泌（图8I-J）。F4/80免疫组化结果证实MeNPs减少炎症组织部位巨噬细胞浸润，可以通过消除氧化应激重塑炎症微环境（图8K-L）。
图 8 MeNP 减少细胞凋亡和炎症。 (A) 结肠组织TUNEL 染色（绿色）和 DAPI（蓝色）合并图像。(B) TUNEL 阳性细胞的定量。(C) 结肠组织匀浆中 Nrf2、Bcl-2 和 Bax 的WB分析。(D-F) Nrf2、Bcl-2 和 Bax 的WB的定量。(G) 结肠组织 Ki-67 阳性细胞的检测和 (H) 定量。各组 (I) IL-6和 (J) IL-10表达水平。(K) 结肠切片 F4/80 的免疫组化染色和 (L) 定量。
7、MeNPs修复肠道屏障
MeNPs治疗后恢复肠道形态，并可见明显的紧密连接（图9B）。MeNPs可以将紧密连接蛋白：黏附连接蛋白（E-cadherin）、紧密连接跨膜蛋白（Occludin）和外周膜蛋白（Zona occludens 1, ZO-1）的表达大幅度上调，促进紧密连接复合物的组装，恢复并维持肠道屏障功能（图9C-F）。
图 9 MeNPs 修复肠道屏障。 (A) MeNPs 调节肠道微环境的机制示意图。(B) 小鼠组结肠组织微观结构变化的 TEM 图像。(C) 结肠组织中 ZO-1（上）、occludin（中）和 E-cadherin（下）的免疫荧光染色。(D) ZO-1 和 occludin 阳性细胞的定量。(E) 每组结肠组织匀浆中 ZO-1、E-cadherin和 occludin 蛋白的 WB 分析。(F) 结肠组织中 ZO-1 和 occludin 的WB的定量。
8、MeNPs调节肠道菌群
MeNPs治疗后肠道菌群构成发生显著变化（图10A-B），肠道菌群益生菌水平升高，致病菌丰度大幅度降低（图10C）。MeNPs治疗组中益生菌双歧杆菌水平升高8倍（图10D），副拟杆菌、另枝菌、拟杆菌和大肠杆菌志贺菌分别降低至结肠炎组的15.4%、8.6%、15.3%、2.5%（图10E-H），提示MeNPs不仅能够修复肠道屏障还能调节菌群平衡，恢复病灶部位微环境。
图 10 MeNPs 调节肠道微生物群。(A) 健康组、结肠炎组和 MeNPs 治疗组的肠道微生物组中相对丰度条形图。(B) 基于肠道微生物组成和组间丰度差异的非度量多维尺度分析 (NMDS) 图。(C) 30 个最丰富的微生物类别的相对丰度热图。(D-H) 每组肠道微生物样本中双歧杆菌、副拟杆菌、另枝菌、拟杆菌和大肠杆菌/志贺氏菌的相对丰度。
03
研究总结
该研究开发了具有抗氧化能力的口服MeNPs用于治疗 IBD。在结肠炎小鼠中，MeNPs在增加体重、恢复肠长和缓解炎症表现等方面都发挥了令人满意的效果。这项工作展示了MeNPs作为IBD口服治疗药物的巨大潜力，它不仅具有非常强的消除多种ROS的能力，而且在消化液中十分稳定。MeNPs被证明可以准确持续靶向病灶，并能通过缓解氧化应激和内质网应激、消除炎症、恢复肠道环境等多种途径有效治疗IBD，且无明显不良反应。该工作为IBD的纳米药物治疗研究领域提供了一个有前景的策略，为IBD的临床治疗提供了理论和实验依据。
参考文献
[1] K. Clarke, J. Chintanaboina, Allergic and Immunologic Perspectives of Inflammatory Bowel Disease, Clinical Reviews in Allergy & Immunology, 57 (2019) 179-193.
[2] A. Larabi, N. Barnich, N. Hang Thi Thu, New insights into the interplay between autophagy, gut microbiota and inflammatory responses in IBD, Autophagy, 16 (2020) 38-51.
[3] E.L. Campbell, S.P. Colgan, Control and dysregulation of redox signalling in the gastrointestinal tract, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 16 (2019) 106-120.
[4] C.H. Chung, W. Jung, H. Keum, T.W. Kim, S. Jon, Nanoparticles Derived from the Natural Antioxidant Rosmarinic Acid Ameliorate Acute Inflammatory Bowel Disease, Acs Nano, 14 (2020) 6887-6896.
课题组简介
黄琼：中南大学湘雅医院药学部，副教授，博士生导师，药理学博士，约翰霍普金斯大学医学院博士后，学术带头人。主要从事临床药理学、抗糖尿病药物药理、纳米药物在糖尿病及其并发症中的研究。主持国家自然科学基金项目3项，省部级其他课题等9项课题。担任2022年全国高等学校药学类专业研究生规划教材《药物遗传学》的编委，参编英文专著1部，申请专利4项。共发表论文84篇，第一作者/通讯作者52篇，其中SCI收录40篇。
艾可龙：中南大学湘雅药学院药理学系，特聘教授，博士生导师，中南大学临床药学研究与转化中心副主任，连续两年入选“全球顶尖前10万名科学家”榜单，湖南省杰出青年基金获得者。主要从事氧化应激在心脑血管损伤的机制研究及操控 ROS 的纳米药物在重大疾病中的应用研究。近年来于国际权威学术期刊上发表SCI论文77篇，以一作或通讯作者身份发表的论文中影响因子大于10的34篇，大于15的21篇，论文他引>13000次，H-因子为40。申请发明专利10余项，其中6项已获授权。获省部级一等奖2项，二等奖1项。
吴畏：中南大学湘雅医院副院长，教授、主任医师，医学博士，美国德州大学休斯顿健康科学中心博士后，博士生导师。主攻胃肠道肿瘤基础与临床、腹膜假性粘液瘤诊治、炎性肠病的外科治疗，长期致力于危重疑难疾病的处理。主持并参与国家级、省部级课题10余项，以第一作者或通讯作者身份发表科研论文30余篇，其中SCI论文20余篇。
转自：“NANO学术”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
