Biosens. Bioelectron.|智能手机辅助的生物酶-纳米酶-显色底物一体化测试片用于对氧磷的便捷检测

以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者纳米酶 Nanozymes

监测食品和环境中的农药残留是保障食品安全和生态健康的重要举措，然而如何实现高灵敏且便捷的分析检测一直存在挑战。近期，研究人员将生物酶、纳米酶和显色底物巧妙集成在一起，构建了一种一体化测试片，在智能手机辅助下实现了对农药残留的高灵敏、便捷化测量。首先，采用连续自组装方法获得生物酶-纳米酶-显色底物组装体，再利用水凝胶将该组装体一并负载到纸片上，便获得能对农残快速响应的测试片。由于邻近效应和限域效应，构建的生物酶-纳米酶-显色底物一体化级联体系具有优异的催化效率，有利于实现高灵敏检测。因所有传感元件均集成于同一测试片中，极大地简化了检测操作步骤，为现场快速分析提供了可能。此外，水凝胶载体提供的微环境也使测试片具备良好的传感稳定性。此智能手机辅助的一体化测试片能用于多种样品中对氧磷的检测，具有优异的应用前景。

图1. 本工作与传统农残分析方法的对比。

研究内容：

1、一体化测试片的制备与表征

图2A显示一体化测试片的制备过程。首先利用自组装方法制备TMB-hemin-BSA组装体，随后利用静电相互作用将乙酰胆碱酯酶（AChE）和胆碱氧化酶（ChO）组装到TMB-hemin-BSA表面，最后利用生物相容性好的海藻酸盐水凝胶将一体化组装体固定到试纸上，便得到高度集成化的农残测试片。UV-Vis光谱证明了TMB、hemin和BSA的成功自组装（图2B）。SEM图像验证了TMB-hemin-BSA组装体具有一维棒状结构（图2C）。通过Zeta电位测试和激光共聚焦荧光显微成像（图2D和2F），证实天然酶可以通过静电相互作用固定到TMB-hemin-BSA表面（图2E）。XPS光谱（图2G）证实在TMB-hemin-BSA-AChE-ChO一体化组装体中存在C、N、S和Fe等元素。通过图2H可以观察到TMB-hemin-BSA-AChE-ChO组装体和海藻酸盐水凝胶共同固定在纸纤维表面。图2I为研制的生物酶-纳米酶-显色底物一体化测试片的数码照片。

图2. 一体化测试片的制备与表征。

2、一体化测试片的级联催化行为

图3. 组装体的级联催化过程及优化。

图3A显示AChE-ChO-hemin三者的级联催化反应。在引入底物乙酰胆碱（ACh）后，AChE会催化ACh分解为胆碱，并触发ChO催化氧化胆碱产生H2O2，后者可在hemin的催化作用下将TMB氧化生成蓝色产物TMBox。在滴加ACh后，一体化测试片的显色结果验证了上述过程（图3B）。为获得最佳的级联催化效果，作者系统研究了影响催化/响应效率的多个关键参数，发现在TMB-hemin-BSA的制备过程中BSA的最佳用量为90 mg，显色底物TMB与hemin的最佳比例为1：0.6，最佳反应pH为5.0（图3C、3E和3F）。当TMB-hemin-BSA组装体触发显色反应时，TMB-hemin-BSA的最佳用量为0.035 mg/片。考虑到生物酶的利用和固定化效率，作者也对级联反应过程中AChE和ChO的使用量进行了评估，发现其最佳剂量分别为0.01 U/片和0.35 U/片。

3、一体化测试片检测农残的可行性验证

图4. 一体化测试片对农残的响应机理及检测性能评价。

如图4A所示，当有机磷或氨基甲酸酯类农药被引入后，它会与AChE不可逆地结合，导致后者失活，阻断H2O2的产生途径，从而抑制TMB的催化显色反应。实验结果验证了上述机理，当添加对氧磷时，测试片颜色变为几乎无色（图4A和4B）。作者比较了一体化测试片和游离级联体系的催化效率，结果表明由于邻近效应和限域效应，一体化测试片的级联催化效率是游离体系的1.22倍（图4C）。为实现对农残的高性能检测，作者进一步优化了两种生物酶（即AChE和ChO）在静电自组装过程中的总用量，确定生物酶与TMB-hemin-BSA的最佳比例为1.03:1（图4D）。

4、智能手机辅助的一体化测试片对农残的检测

图5. 智能手机辅助的一体化测试片对农残对氧磷的检测。

为实现对农残的无器械、方便、快速检测，作者进一步构建了一种智能手机信号读取系统用于农残的定量传感。如图5A所示，以灰度值为信号，智能手机在对测试片颜色信息进行分析并与内置的标准曲线进行对标后，就可直接显示农残的定量信息。利用该系统，作者验证了一体化测试片对农残对氧磷的检测能力（图5B和5C），发现研制的测试片具有较好的抗干扰能力（图5D）和存放稳定性（图5E），可用于多种实际样品中对氧磷的准确测量。该检测系统具有良好的灵敏度，主要源于组装体级联催化的邻近效应，多孔水凝胶提供的限域效应也有利于提高检测灵敏度。与溶液检测方法相比，研制的测试片将所有传感元件集成于一体，大大简化了操作步骤，为实现现场式快速分析提供了潜在可能。

结论

作者开发了一种智能手机辅助的一体化测试片，通过将生物酶、纳米酶和显色剂合理地集成于一体，实现了对农药残留的高灵敏和便捷分析。该一体化设计缩短了级联反应中物质的扩散，为目标物感应提供了高灵敏度。同时，所有的传感元件均集成于同一测试片上，检测程序大大简化，方便检测。研制的一体化测试片表现出优异的检测性能，具有高灵敏度、强抗干扰能力以及良好的稳定性。另外，本研究验证了可对实际样品的准确分析，证实该智能手机辅助测试片检测方法的可行性。这种生物酶-纳米酶-显色底物一体化策略可以扩展到其它多酶生物传感器的研制，不仅为高灵敏和便捷的农药残留监测提供了新工具，也能启发高效酶基生物传感平台的开发。

转自：“NANO学术”微信公众号

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