以下文章来源于食品安全质量检测 ，作者食品安全质量检测
适配体(aptamer)是运用指数富集配体进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)从体外人工合成的随机寡核苷酸库中筛选得到的, 能高亲和、特异性识别靶标物质的一段寡核苷酸序列(DNA/RNA)。它们可以通过非共价键与靶标结合, 形成复杂的三维形状, 如茎、环、发夹、G-四联体结构。近年来, 适配体已被运用到食品、医药、环境等多种领域。相较抗体, 适配体具有合成时间短, 潜在目标范围宽, 稳定性好, 可长期保存等优点, 此外, 还能在不丧失亲和力的情况下进行各种类型的修饰。基于这些特性, 在某些领域, 适配体被认为有望代替抗体。近年来, 研究人员利用适配体开发了多种致病菌检测方法, 包括比色、表面增强拉曼散射、荧光和电化学方法等, 利用适配体大大缩减了原先利用抗体时复杂的合成和修饰过程。
磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)是一类尺寸在1~100 nm之间的磁性纳米材料, 具有纳米材料的小尺寸效应、比表面积效应和其特有的磁性, 已广泛应用于生物医学、食品安全、能源、环境等领域。当MNPs的粒径小于其超顺磁性临界尺寸时, 粒子进入超顺磁性状态, 这种特殊的磁性使粒子可通过外部磁体实现快速分离, 并在没有磁场的情况下迅速重新分散, 因此, 可以利用MNPs从复杂基质中分离出特定的物质。裸磁性纳米颗粒可能会发生团聚且易被空气氧化, 因此, 在实际应用过程中, 通常会对MNPs进行表面改性, 以提高其稳定性和生物相容性。对MNPs表面进行化学修饰, 使其带有氨基、羧基等功能化官能团是常见的改性措施, 改性后的MNPs可结合生物功能分子, 在多个领域有广泛的应用。
磁性纳米颗粒与适配体结合是一种较为常见的分离目标物方法。适配体表面可通过不同的基团修饰进而在磁性纳米颗粒表面固定, 但在不同修饰基团的适配体与磁性纳米颗粒的结合效果以及结合后对目标物的亲和力是否有差异等方面, 目前还未见报道。因此, 本研究制备了氨基修饰的磁性纳米颗粒, 将其与不同基团修饰的适配体结合, 以常见的致病菌-副溶血性弧菌为例, 通过平板计数, 确定不同基团修饰的适配体对磁性纳米颗粒的修饰效果和活性的影响, 以期为副溶血性弧菌分离与检测的相关研究提供借鉴。
1 磁性纳米颗粒的表征
图1 氨基化Fe3O4的表征
由于裸MNPs具有表面活性强, 易被氧化等特点, 在实际应用中通常需要进行表面修饰, 因此, 本研究利用1,6-己二胺一步制得表面氨基修饰的MNPs, 精简了实验过程。通过改变反应条件, 合成了4种不同反应时间的磁性纳米材料, 并通过TEM、XRD、FTIR和粒径分析对合成的材料进行表征。FTIR结果显示(图1a), 不同反应时间所制得的磁性纳米颗粒的特征吸收峰位置基本一致, 580 cm‒1左右有属于Fe-O的特征吸收峰, 1051 cm‒1处有-CH2-键的拉伸振动峰, 1640 cm‒1左右有属于NH键的弯曲振动峰, 由此证明氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒成功合成, 反应时长为10 h时所合成的磁性纳米颗粒的吸收峰锐度更强。XRD结果显示(图1b), 该图与Fe3O4的X射线衍射标准卡对比基本一致, 不同反应时间合成的磁性纳米颗粒在XRD谱图上未见有明显区别。将4份样品材料超声分散, 利用马尔文纳米粒度电位分析仪对材料的尺寸进行测定, 结果表明不同反应时间下合成的磁性纳米颗粒尺寸均小于100 nm。粒度电位仪结果显示, 反应时间分别为4、6、8和10 h条件下, 合成的磁性纳米颗粒分别为（58.711±5.777）、（37.84±3.241）、（28.214±6.28）和（24.36±4.36） nm, 尺寸随着反应时间的增长而逐渐减小。为检测不同反应时间下合成的氨基修饰磁性纳米颗粒与适配体的结合效率, 将2 mg/mL的磁性纳米颗粒与10 mL 25 mmol/L氨基修饰的适配体结合, 通过对反应残留上清液的紫外吸收谱图可以看出(图1c), 反应时间为10 h条件下合成的磁性纳米颗粒与适配体的结合率最高。因此, 结合上述结果, 选择反应时间为10 h合成的磁性纳米颗粒作为后续实验材料。对10 h该磁性纳米颗粒进行TEM表征(图1d), 结果表明纳米粒子均为分布均匀的球形。在外加磁场的作用下, 分散在溶液中的磁性纳米颗粒能快速分离聚集, 从磁滞回线来看, 材料的磁化强度随着外加磁场强度的增加而增加, 并迅速达到饱和状态, 磁化曲线呈现“S”型, 表明合成的材料在室温下表现超顺磁性。
2 磁性纳米颗粒与适配体的结合
2.1 氨基修饰的适配体与磁性纳米颗粒的结合
图2 氨基化磁性纳米颗粒与氨基修饰的适配体结合后上清液的紫外吸收图谱
合成的磁性纳米颗粒表面带有氨基, 可与5’端修饰了氨基的适配体利用戊二醛进行交联, 从而实现磁性纳米颗粒的适配体功能化修饰。由于适配体是一段核苷酸链, 在260 nm处有特征吸收峰因此, 可通过分析在260 nm处适配体原液和与磁性纳米颗粒结合后上清液的吸光度来间接表征磁性纳米颗粒与适配体的结合情况。2 mg/mL氨基化Fe3O4与20 mL 25 mmol/L氨基修饰的适配体反应后, 紫外吸收谱图如图2所示, 相较于适配体原液, 磁性纳米颗粒与适配体结合磁分离后的上清液在260 nm处的吸光度明显降低, 说明氨基化磁性纳米颗粒与氨基修饰的适配体成功结合。根据260 nm处吸光度的下降值, 可以得出磁性纳米颗粒与氨基适配体的结合率为40.02%, 适配体在磁性纳米颗粒上的负载量为5.00 mmol/(L·mg)。
2.2 生物素修饰的适配体与磁性纳米颗粒的结合
图3 氨基化Fe3O4与生物素修饰的适配体结合的紫外吸收图谱
氨基化Fe3O4与生物素修饰适配体的结合需链霉亲和素作为连接臂。首先, 将氨基化Fe3O4与SA反应后测量280 nm处的吸光度。结果显示(图3a)磁性纳米颗粒与SA结合后的上清液在280 nm处的吸光度明显降低, 表明SA成功连接到磁性纳米颗粒表面。氨基化Fe3O4与SA成功结合之后, 利用亲和素与生物素之间具有高度亲和力的特点, 将生物素修饰的适配体与磁性纳米颗粒结合, 通过结合后上清液在260 nm处的吸光度来表征适配体的结合情况。结果同样显示磁性纳米颗粒与生物素修饰的适配体成功结合, 根据260 nm处吸光度下降值, 可以得出2 mg/mL磁性纳米颗粒与20 mL 25 mmol/L 生物素适配体的结合率为62.16%(图3b), 生物素适配体在磁性纳米颗粒上的负载量为7.63 mmol/(L·mg)。根据氨基化磁性纳米颗粒与氨基和生物素修饰的适配体结合后的紫外吸光度结果, 可以看出对于相同浓度的氨基化磁性纳米颗粒溶液, 生物素修饰的适配体结合率更高, 这可能由于生物素和亲和素之间连接臂的反应活性高于磁性纳米颗粒表面的氨基活化为醛基后与氨基的反应活性。
2.3 适配体功能化修饰的磁性纳米颗粒对副溶血性弧菌的分离效果分析
图4 不同基团适配体修饰的磁性纳米颗粒的磁分离效果
将不同基团修饰的适配体功能化纳米磁性颗粒与105、104、103 CFU/mL浓度的菌液于37°C孵育后, 经磁分离后取残余上清液进行平板涂布, 培养后计数, 通过适配体功能化的磁性纳米颗粒对副溶血性弧菌的分离效果来分析不同基团修饰对适配体活性的影响。如图4所示, 3种基团修饰的适配体与纳米磁性颗粒结合后对副溶血性弧菌均有一定的分离效果。对低浓度的副溶血性弧菌而言, 3种基团修饰的适配体对菌液的分离率均在90%, 无显著差异。但当菌液浓度增大时, 氨基适配体修饰的磁性纳米颗粒对目标物的分离效果要高于生物素和羧基修饰的磁性纳米颗粒; 当菌液浓度为105 CFU/mL时, 氨基适配体结合的磁性纳米颗粒对副溶血性弧菌的分离率为69.24%, 但生物素和羧基修饰的磁性纳米颗粒的分离率低于50%，表明不同基团修饰的适配体与副溶血性弧菌的结合效率有一定的差异。相对于生物素和羧基, 氨基修饰的副溶血性弧菌适配体具有更高的生物活性。适配体结构复杂, 不同修饰基团对特定适配体空间构象的影响以及对靶标识别效果的机制研究少有报道, 需在将来进行进一步的研究与探讨。
结 论
本研究成功合成氨基化Fe3O4纳米颗粒, 通过与不同基团修饰的副溶血性弧菌适配体在氨基化Fe3O4纳米颗粒表面固定效率的分析比较, 发现在相同条件下氨基修饰和生物素修饰的副溶血性弧菌适配体在氨基化Fe3O4纳米颗粒表面的固定率分别为40.02%和62.16%。对副溶血性弧菌的分离效果显示, 氨基修饰的副溶血性弧菌适配体在Fe3O4纳米颗粒上固定后具有更为优异的反应活性, 说明氨基化的副溶血性弧菌适配体对磁性纳米颗粒的活性影响较低, 为副溶血性弧菌适配体的在磁性纳米颗粒表面的固定条件研究提供了参考。
基金项目：浙江省重点研发计划项目(2021C02061)、浙江省教育厅一般项目(Y202044888)
稿件来源：吴丽, 宋新杰, 吕天凤, 张尧, 孙娟, 王鼎南, 柯庆青, 杜云霞, 吴元锋. 不同修饰基团的副溶血性弧菌适配体在磁性纳米颗粒表面的固定效果和反应活性研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2023, 14(1): 220-226.
通信作者简介
吴元锋教授
吴元锋，博士，教授，硕导，生物与化学工程学院副院长，食品营养与健康研究所所长；兼任中国进出口检验检疫协会国境口岸食品标准化技术委员会副秘书长、浙江省食品学会理事、浙江省食品学会青年工作委员会副秘书长、浙江省食品工业协会理事、浙江省微生物学会理事等；浙江省高校中青年学科带头人，浙江省151人才，“泰州市高层次创新创业人才引进计划”资助对象，校科大青年英才；主要从事食品中的天然产物活性研究，以及危害因子筛查技术研究。主持获得浙江省科学技术进步奖二等奖1项（1/9）、参与获得中国商业联合会科学技术奖一等奖1项（5/13）；主持国家和省级项目9项，横向项目10余项；在Journal of Agricultural and Food Chemistry、Journal of Functional Foods、Food Chemistry、Carbohydrate Polymers、Food Research International等国际知名期刊发表论文40余篇，其中第一或通讯作者SCI收录11篇；授权国家发明专利13件，其中第一专利权人4件；参与编写著作教材4部。
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