New Phytologist |华中农业大学端木德强课题组揭示硝酸盐诱导根瘤衰老的新机制

近日，华中农业大学端木德强团队在《New Phytologist》在线发表了题为“A transcription factor of the NAC family regulates nitrate-induced legume nodule senescence”的研究论文。该研究揭示了豆科植物百脉根中一个NAC转录因子在硝酸盐诱导的根瘤衰老过程中发挥了关键的调控作用。

研究背景：

豆科植物能够与根瘤菌建立共生关系，形成具有固氮能力的根瘤。硝酸盐是影响根瘤共生的关键环境因子，适当浓度的硝酸盐可以促进结瘤固氮，但过量的硝酸盐能够抑制根瘤菌侵染、根瘤发育以及共生固氮等多个过程，并且显著促进根瘤衰老。已有研究表明NLP (NIN-LIKE PROTEIN)家族的转录因子是硝酸盐信号通路中的关键调控因子，百脉根NLP1和NLP4蛋白的缺失能够阻断高浓度硝酸盐对根瘤固氮多个过程的抑制作用。然而NLPs调控根瘤固氮以及根瘤衰老的具体机制仍不清楚。

研究结果：

本研究以百脉根为模式豆科植物，对固氮根瘤进行高浓度硝酸盐的处理实验，对处理后不同时间点的根瘤样品进行转录组测序分析，结合前人发表的sen1和lb123两个根瘤早衰突变体的转录组数据，鉴定到一个三组数据共有且唯一共有的根瘤衰老正调控因子，该基因受硝酸盐诱导上调表达，且在突变体早衰根瘤中显著上调表达。由于该基因与拟南芥ANAC094的同源关系，将其命名为LjNAC094。进一步通过构建NAC094的稳定超表达株系(NAC094-OE)对该基因进行功能验证，发现NAC094的超表达显著促进了根瘤衰老。通过对NAC094-OE的转录组数据分析发现，NAC094调控的基因与硝酸盐响应基因存在很大程度的重叠。

通过DNA亲和纯化测序(DAP-seq)，本研究在全基因组尺度上捕获NAC094的调控靶点，利用EMSA以及转录激活实验对代表性衰老相关基因进行验证，包括半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteases; CYPs)、溶菌酶(Lysozyme; LYS)、肽转运蛋白(Peptide transporter; PTR)以及铜转运蛋白(Copper transporter; COPT)。其中半胱氨酸蛋白酶和溶菌酶参与了根瘤衰老过程中蛋白质的降解以及细胞裂解过程，而肽和铜转运蛋白可能参与了根瘤衰老过程中营养物质的回收利用。

本研究进一步构建了nac094突变体，发现NAC094的缺失能够部分缓解硝酸盐诱导的豆血红蛋白的降解，同时几乎阻断了根瘤中硝酸盐诱导的根瘤衰老相关基因的上调表达。这说明NAC094对于衰老相关基因的表达至关重要，这些基因中包含了可能参与豆血红蛋白降解的半胱氨酸蛋白酶基因。为了验证NAC094与NLP1/NLP4的上下游调控关系，对nlp1、nlp4和nlpl nlp4突变体根瘤进行硝酸盐处理，结果发现NLP1/NLP4的缺失阻断了NAC094及其调控基因受硝酸盐的诱导表达。这说明NAC094作用于NLP1和NLP4的下游，调控根瘤衰老相关基因的表达。另外，转录激活实验结果表明，NLP1和NLP4不能直接激活NAC094的表达，表明NAC094与NLP1/NLP4之间存在其他未知的信号转导组分。

本研究进一步对硝酸盐处理后的野生型以及nac094突变体根瘤进行代谢组学分析，发现多种二肽和核苷酸分子在硝酸盐处理后的野生型根瘤中明显积累，而在nac094突变体根瘤中变化不大。另外还发现了一大类磷脂分子在处理后的野生型根瘤中含量显著降低，而nac094突变体根瘤中变化并不显著。二肽和核苷酸可能分别是根瘤衰老过程中蛋白质和核酸的降解产物，而磷脂分子可能是根瘤衰老过程中主要的降解靶标。结合转录组数据分析发现，大量编码蛋白酶、肽酶、核酸酶以及磷脂酶的相关基因受硝酸盐诱导上调表达，并在NAC094超表达根瘤中显著上调表达，这些NAC094参与调控的基因参与了衰老根瘤中的物质降解相关过程。

综上所述，在硝酸盐诱导的根瘤衰老过程中，NAC094作为根瘤衰老的正调节因子发挥功能，NAC094作用于NLP1/NLP4下游，通过激活特定的衰老相关基因参与调控硝酸盐诱导的根瘤衰老，这些衰老相关基因可能参与了细胞裂解、生物大分子降解、营养物质回收再利用等诸多过程。该研究揭示了硝酸盐信号诱导根瘤衰老的关键调控因子，多种组学数据为研究根瘤衰老的信号转导和物质代谢途径奠定了良好的基础。nac094以及nlp1 nlp4等突变体材料的鉴定也为缓解环境中高硝酸盐对于豆科植物根瘤固氮的抑制作用提供了潜在策略。

华中农业大学博士后王龙龙为本文的第一作者，华中农业大学生命科学技术学院、农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室、湖北洪山实验室端木德强教授为通讯作者。研究得到了国家自然科学基金、中国博士后科学基金、中央高校基本科研专项资金以及生科院博士后百川计划的支持。

原文链接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/nph.18896

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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