Nucleic Acids Research|Cas9脱靶结合宿主基因启动子导致基因沉默和细胞毒性

在过去的十年里，Cas9蛋白已被用作细菌的强大遗传工具。引导RNA可通过靶标位置的PAM靶向任何感兴趣的基因，目前，CRISPR基因编辑系统除了能够引入双链断裂的基因组编辑应用外，还衍生了CRISPRa和 CRISPRi技术，通过激活或抑制转录来调控靶基因的表达。这主要是通过Cas9的变体（dCas9）实现的， 虽然Cas9衍生工具已经证明对细菌有效，但研究报告表明，当dCas9与在PAM近端带有特定5nt的引导RNA结合（也称为种子序列）时，可以抑制大肠杆菌的生长，我们称之为“坏种子”效应，在1024种可能的5nt组合中，超过100种导致适应性显著降低，从生长速率的轻度降低到完全抑制菌落形成，这种“坏种子”效应取决于细菌中dCas9的浓度，并且可以调整dCas9表达水平达到降低毒性，同时仍然保持良好的靶向活性的目的；然而，到目前为止，造成这种毒性现象的机制仍然很神秘。

近日，Nucleic Acids Research在线发表了题为“Cas9 off-target binding to the promoter of bacterial genes leads to silencing and toxicity”的研究论文，研究人员解释了dCas9与携带“坏种子序列”的引导RNA特异性毒性背后的机制，证明了这种毒性是由dCas9与必需基因启动子的脱靶结合引起的，它可以阻断表达并抑制细胞生长；在大肠杆菌和其他肠道细菌的各种菌株中进行的筛选表明，毒性引导RNA的性质随着脱靶位置序列的进化而变化；突出了dCas9与细菌基因组中数百个脱靶位置结合的潜力，从而导致不希望的结果。在细菌CRISPR–Cas实验的设计和解释中必须考虑这一现象。

研究人员首先用随机引导RNA库进行了CRISPRi筛选，证实了带有特定5nt种子序列引导RNA的毒性，这种毒性与引导RNA的其他15nt或染色体中是否存在完全互补的靶标无关。

图一 随机引导RNA文库鉴定坏种子序列。

接着，研究人员通过RNAseq研究了两个最耗尽的5-nt AGGAA和ACCCA的转录反应。通过计算相对于无毒引导RNA的表达倍数变化来进行差异表达分析，发现在AGGAA不良种子序列条件下，两个最显著被抑制的基因是glyQ和glyS，而rpmH是ACCCA样本中最显著被压抑的基因，为了研究这些基因的抑制是否是含有AGGAA种子序列的guide RNA毒性的原因，研究人员在质粒上克隆了glyQS操纵子及其启动子。然后将该质粒引入菌株LC-E18中， dCas9在存在具有AGGAA序列的引导RNA或对照引导RNA的情况下均高水平表达，但但菌落仍然比对照引导RNA存在时的菌落小。研究人员检查glyQS操纵子的启动子时，发现它包含一个可能的AGGAA引导的脱靶结合位点，该位点与转录起始位点重叠，将这种脱靶的PAM位点从NGG突变为NCG，则完全消除了AGGAA“坏种子效应”。接着，研究人员检测发现其他有毒种子序列都可以通过与必需基因启动子的脱靶结合来解释。

图二 “坏种子效应”是由必需基因启动子的脱靶结合引起的。

图三 鉴定导致一些“坏种子序列”毒性的脱靶位点。

为了研究dCas9与导致毒性的脱靶位置的结合是否特别强，研究人员在AGGAA或ACCCA引导RNA存在的情况下，使用FLAG标记的dCas9进行了ChIP-seq测定。结果显示dCas9在整个基因组的脱靶位置普遍结合。

图四 在存在毒性AGGAA或ACCCA引导RNA的情况下，dCas9与大肠杆菌染色体结合的ChIP-seq分析。

为了测试不同菌株和物种的毒性种子序列会不会由于基因和启动子序列的变化可能会有所不同。研究人员将随机引导RNA文库引入了八个大肠杆菌以及其他肠道细菌物种中，发现毒性序列的性质因菌株和物种而异，反映了脱靶位置DNA序列的差异以及基因表达如何影响细菌生长的变化。

图五  通过12种肠杆菌科筛选辨别毒种子序列的变化

原文链接：

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkad170/7079636

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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