以下文章来源于Mol Plant植物科学 ，作者供稿者 | Claudia
佐剂（adjuvant）添加到疫苗中后，可非特异性地增强机体对该抗原的免疫应答，又称为非特异性免疫增强剂。长期以来，临床使用的佐剂为铝盐或角鲨烯乳液，但效果差副作用大。自上世纪天然表面活性剂（皂苷）被用作兽药的佐剂。最近第一个皂苷佐剂 AS01被批准用于人类带状疱疹疫苗Shingrix和疟疾疫苗Mosquirix。AS01是由单磷酰脂质 A 和皂苷QS-21构成，二者协同作用增强了抗体和辅助 T 细胞反应。QS-21只是智利皂皮树产生的100多个皂苷之一，它与QS-7和QS-17一起被用于Novovax的新冠疫苗 NVX-CoV2373 中。尽管皂苷佐剂效果好，但由于其化学结构的复杂性，目前QS皂苷的唯一来源仍是皂皮树中提取。
2023年03月24日，Science在线发表了英国约翰英纳斯中心Anne Osbourn团队及其合作者题为“Elucidation of the pathway for biosynthesis of saponin adjuvants from the soapbark tree”的研究论文。该文解析了智利皂皮树基因组的基础上，通过基因组数据挖掘结合烟草瞬时表达，首先鉴定出合成QS中间体的16种酶，并达到了制备级水平，彰显了植物瞬时表达系统的强大；接着阐明了疫苗佐剂QS-7的合成过程，在异源烟草中QS-7的含量已达到了皂皮树中除树皮外的其他组织的同等水平。本研究为开发“环境友好”“free-from-tree”的免疫佐剂生产方式与新的免疫佐剂分子奠定了基础。
疫苗在传染病预防中取得了巨大的成功。疫苗通常需要一种佐剂来增强对抗原的免疫应答反应。但迄今为止，只有少数佐剂被批准用于人类疫苗。智利皂皮树（Quillaja saponaria）中的三萜糖苷（皂苷，QS）具有激活抗体和细胞免疫反应的双重功效，是一种优良的佐剂，如QS-21, QS-17, QS-7均已被用于疫苗佐剂，其中QS-7与QS-21具有相同的母核，但在C-28的修饰不同。由于它们化学结构的复杂性，目前唯一的来源是从皂皮树的树皮中提取，但由于皂皮树有100多种QS，提取后还需要进一步分离纯化，这给环境与植物资源保护、生产应用都带来了困难。因此，解析QS的生物合成途径将为深入了解皂苷的合成与演化提供新的见解，并为佐剂的异源合成、免疫激活特性与毒性的优化提供了可能。
皂皮酸(Quillaic acid)骨架的生物合成
三萜的前体类异戊二烯2,3-氧化鲨烯(1)（2,3-Oxidosqualene）环化后可形成100多种不同骨架，其中β-香树素(2)(β-amyrin)最常见。QS-7、QS-21、QS-17的母核是皂皮酸(5)(QA)，QA是(2)在C-16α、C-23和C-28的位置氧化后的产物。因此，在研究皂皮树中皂苷的合成之前，首先要找到β-香树素合成和氧化所需的酶。
千种植物转录组计划（1,000 Plants Project，1KP）中已有皂皮树叶片转录组数据，使用甘草的β-香树素合酶GgbAS1调取皂皮树中同源基因，并通过烟草瞬时转化体系进行功能验证，最终获得皂皮树β-香树素合酶基因QsbAS1。接下来要β-香树素的氧化酶，已知的三萜氧化酶大都属于细胞色素P450家族，其中CYP716分支通常参与了三萜中C-28和C-16α的氧化。以已报道的具有C-28氧化活性的蒺藜苜蓿中CYP716A12为诱饵，检索皂皮树中同源基因，其中CYP716A224与QsbAS1共表达几乎将β-香树素完全转化为齐墩果酸（Oleanolic acid），CYP716A297将产物进一步氧化为新产物棘囊酸(4)，作者从皂皮树转录组中余下的35个全长CYP中筛选到CYP714E52能接着将产物氧化为QA（图1），在烟草中进行大规模瞬时表达，纯化了约30毫克QA。
图 1.QA合成途径重建
皂皮树染色体水平（pseudochromosome-level）的基因组组装
植物特异性代谢途径的基因通常是共表达并共定位或“聚集”在基因组上 。共表达分析需要不同组织或处理的RNA-seq数据，而生物合成基因簇的发现依赖于基因组，因此作者对皂皮树进行了转录组和基因组测序。皂皮树基因组大小为411 Mbp，由28条染色体构成，单倍体为14。在不同的皂皮树组织中，QA合成基因高度共表达，在叶原基中最高，老叶中最低，可以作为挖掘QS下游候选基因的参照。plantiSMASH预测皂皮树基因组中有51个生物合成基因簇(BGCs)，其中34个是与“糖类”或“萜烯”类有关。四个QA生物合成基因并不在一起，而其CYP716A297位于糖类BGC附近（簇45），其中一些基因与CYP716A297的表达特征类似，推测其功能可能相关（图 2）
图 2. 皂皮树的基因组和转录组数据
添加C-3糖链
解析了QA 合成途径后，接下来要寻找QA中C-3和C-28位糖基化修饰的酶。催化植物天然产物糖基化的酶通常属于糖基转移酶1 (GT1) 家族，也称为UDP依赖性糖基转移酶 (UGT)。通过对皂皮树基因组UGT基因检索，分析其与QsbAS1的共表达及其在叶原基中的绝对表达水平，筛选到20个UGT基因。其中共表达系数最高的Qs0321930和Qs0321920，连同第三个共表达的UGT基因Qs0321940都位于图2所示的BGC中，该基因簇还包含了类纤维素合酶（CSL）基因Qs0321900。另一个CSL基因Qs0000870虽然不在基因簇中，但与QsbAS1共表达系数很高，暗示其可能参与QS途径。
将两个CSL基因分别与四个QA合成基因共表达，发现它们均催化QA合成了3-O-{β-D-吡喃葡萄糖醛酸}-QA（6；缩写为QA-Mono），由于它们属于CSL-M亚家族，被命名为 CSLM1和CSLM2。接着检测UGT糖基化QA Mono的能力。Qs0123860与QA合成基因和 CSLM1共表达，检测到3-O-{β-D吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸}-QA（7；缩写为QA-Di）新产物的产生。因此，Qs0123860 (UGT73CU3)编码了一个能在C-3位添加第二个糖的QA-3-O-葡糖苷酸-β-1,2-半乳糖基转移酶。Qs0283870(UGT73CX1)编码了木糖基转移酶，Qs0283850 (UGT73CX2)编码了鼠李糖基转移酶，催化QA-Di分别合成3-O-{β-D-吡喃木糖基-(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸}-QA（8；简称QA-TriX）和3-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸}-QA (9; 简称QA-TriR)。
添加C-28糖链
QS-7、QS-21和QS-17具有相同母核，由QA骨架、C-3糖链和C-28 位由D-岩藻糖、L-鼠李糖、D-木糖组成、D-芹菜糖构成四糖链组成。
研究表明C-3糖基化可能先于C-28位置（图 3）。UGT基因Qs0321930(UGT74BX1)与 QsbAS1高度共表达且基因簇45中，它催化D-岩藻糖通过酯键链接到8号产物的C-28位，形成10（缩写为 QA-TriX-F）。Qs0321920（UGT91AR1）与QsbAS1高度共表达，与UGT74BX1相邻，也位于基因簇45中，它编码鼠李糖基转移酶，催化10生成QA-TriX-FR(12)。Qs0234120 (UGT91AQ1)是C-28 木糖基转移酶产生QA-TriX-FRX(14)。
图 3. QS-7、QS-21和QS-17结构
与QA的C-3糖苷相比，C-28糖苷产量极低微量，前体QA-TriX大量积累，说明从QA-TriX到QA-TriX-F的转换效率极低，是C-28糖苷合成的瓶颈。基因簇45还包含两个短链脱氢酶/还原酶(SDR) 基因。其中Qs0321910紧邻UGT91AR1并具有相似的表达模式。糖核苷酸互变酶是SDR家族成员。将SDR与QA-TriX-F的合成酶基因共表达QA-TriX-F水平大幅增加，表明SDR在QA的D-岩藻糖基化中起了重要作用。接着利用SDR来尝试生产新的UGT产物。我们先前获得的QA-TriR大约是QA-TriX的两倍，因此使用QA-TriR骨架进行C-28苷化修饰。UGT74BX1、UGT91AR1、UGT91AQ1依次催化QA-TriR产生QA-TriR-F(11)、QA TriR-FR(13)和QA-TriR-FRX(15)。C-28位四糖支链的末端可以是D-木糖或D-芹菜糖。Qs0234130(UGT73CY3) 和 Qs0234140(UGT73CY2)位于7号染色体基因簇31中，与先前表征的位于11号染色体基因簇45中的C-28木糖基转移酶UGT91AQ1存在共线性关系，推测可能有共同的进化起源和是基因组复制的结果，催化QA-TriR-FRX在C-28末端分别加上一个木糖基或芹菜糖基，产生QA-TriR-FRXX(17)与QA-TriR-FRXA(19)。Qs0088320(QsAXS)编码了UDP-D-芹糖/UDP-D-木糖合酶基因，尽管它与QA合成基因没有共定位，但与QsbAS1有强烈的共表达。将它与Qs0234130或 Qs0234140共表达后，产物显著增加（~11倍）。至此鉴定的所有合成路径如图4所示，约有三分之一的QS皂苷来源于这些骨架，是使皂苷多样化的一个重要的分支。
图 4. 产物16-19的全部合成途径
进一步合成QS-7的三个步骤
合成QS-7需要对18的C-28糖链进行三步额外修饰，添加L-鼠李糖、D-葡萄糖，以及乙酰基。将18与葡萄糖基转移酶Qs0321940 (UGT91AP1)、乙酰基转移酶Qs0206480 (QsACT1)、鼠李糖基转移酶Qs0023500(UGT73B44)共同孵育，成共催化产生QS-7皂苷（图 5）。其中只有UGT91AP1位于11号染色体基因簇45中，并与已知的QS基因共表达。QS-7在烟草中的含量达到了7.9 毫克/克干重，这几乎与皂皮树除树皮以外的其他组织中的含量相当。因此，我们成功地阐明QS-7的合成通路并在异源宿主烟草中重组了该途径。
图 5. QS-7的合成
结论
本文表征了14个酶基因，催化了皂皮树中高级中间体七糖苷化三萜糖苷16, 17, 18,和19的合成。使用瞬时植物表达平台，作者成功异源合成QS从QA到QA-TriR-FRXA的途径中间体，并以纯化得到了毫克量级别，展示出瞬时植物表达体系在快速生产这些分子中的强大实力。进一步阐明了疫苗佐剂QS-7的制备途径。与QS-21不同，QS-7的细胞的毒性可以忽略不计，但在皂皮树的树皮提取物中含量极低。尽管在烟草中QS-7的含量也很低，但该工作首次开启了异源生产QS-7和其他QS皂苷的可能性。皂皮树的完整基因组序列和转录组资源，为解析QS-21和其他QS皂苷的合成打下了基础。综上所述，这些优势为研究QS皂苷结构与佐剂活性的关系带来可能，最终通过代谢工程设计出具有最佳的免疫刺激活性和低毒性的皂苷。
来源：MP植物科学
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