实用！沉默NbCORE受体基因能显著提高农杆菌瞬时表达成熟烟草植株中的外源蛋白表达水平
2023/3/28 9:22:13 阅读：178 发布者：
以下文章来源于植物生物技术Pbj ，作者H.XF
本氏烟草经常用于瞬时基因表达。除了应用于亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用和酶活性的等研究外，瞬时基因表达在商业上被用于生产抗体、疫苗和其他药物蛋白质。瞬时表达是通过用携带转移DNA（T-DNA）上携带感兴趣基因的二元载体的解除武装的根癌农杆菌渗透叶片或整个植物来实现的。根瘤农杆菌将这种T-DNA转移到植物细胞中并稳定表达。瞬时基因表达的成功率随着本氏烟植株的年龄而降低，尽管其具有更多的生物量和易于渗透的大叶片。这种低基因表达被认为是由根癌农杆菌对冷休克蛋白（CSP）的感知引起的。因为NbCSPR和NbCORE这两种仅能在成熟植物中被检测到的受体都被认为可以感知CSP，但究竟哪一种是CSP受体仍存有争议。
英国牛津大学生物系植物化学实验室Renier A. L.van der Hoorn研究团队近日Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“Depletion of the NbCORE receptor drastically improves agroinfiltration productivity in older Nicotiana benthamiana plants”的研究论文，研究人员发现在对NbCORE进行沉默同时NbCSPR未被沉默的6周龄植物中，CSP感知被消除。重要的是，成熟植物的NbCORE沉默后，GFP荧光和蛋白质水平的增加。在NbCORE受体缺失的植物中，瞬时蛋白质产量的急剧增加，使具有充分发育的成熟植物现在可以用于的蛋白的高效表达，该研究为分子农业的发展提供了新的机遇。
在这里，研究人员通过VIGS沉默了NbCSPR和NbCORE，以研究CSP感知是否阻碍了成熟植物中的重组蛋白高效生产。为了沉默NbCSPR，该团队使用了与先前使用的相同的299bp的NbCSPR基因片段，并将其克隆到表达烟草脆裂病毒（TRV2gg）RNA2的载体中。类似地，将NbCORE特异性的300bp片段克隆到TRV2gg中。使用的沉默片段与NbCORE和NbCSPR的编码序列的比对表明，交叉沉默是不可能的。携带GUS片段的TRV（TRV:：GUS）作为阴性对照。用携带沉默片段的TRV感染2周龄的本氏烟植物。与TRV：：GUS植物相比，TRV：NbCSPR和TRV：NbCORE植物没有发育表型。
图1 NbCORE沉默消除了较老的本氏N.benthamiana植物中csp22的反应性，并增加了瞬时蛋白质的产生
对4周龄和6周龄VIGS植物的叶盘进行csp22诱导的活性氧爆发测试。重要的是，csp22诱导的活性氧爆发在6周龄的TRV:：NbCORE植物中不存在，并且存在于TRV：：NbCSPR植物中，与TRV：GUS对照植物相当（图1b）。如前所述，较幼龄的4周龄植株只有非常弱的csp22诱导反应，每批植物的反应可能不同（图1b）。这些数据表明，NbCORE对csp22诱导的本氏烟成熟植株活性氧爆发至关重要。研究人员的数据表明，NbCSPR对于csp22感知是不必要的。NbCSPR不足以用于csp22认知。
为了研究NbCORE的沉默在多大程度上促进了瞬时基因表达，研究人员用农杆菌对6周龄TRV：：GUS和TRV：∶NbCORE植物进行了农杆菌渗透，农杆菌通过一个强大的35S启动子驱动传递增强的GFP，并在五天后对农杆菌渗透叶片进行荧光扫描。在TRV:：NbCORE植物中检测到明亮的GFP荧光，而在TRV：：GUS植物中几乎没有检测到任何荧光（图1c），相当于GFP荧光增加了近八倍（图1d）。在浸润8周龄的植物时观察到类似的荧光增加（图1d）。蛋白质印迹分析证实，与TRV：：GUS对照植物相比，TRV：NbCORE植物中的GFP蛋白水平显著增加。
研究人员的数据表明，NbCORE是csp22诱导的活性氧爆发所必需的，并且NbCORE的瞬时表达赋予csp22对幼龄植株叶片的响应性。在TRV:：NbCSPR植物中，csp22诱导的活性氧爆发与TRV：：GUS对照相似，这与早期的工作相矛盾。但是研究人员的数据与NbCSPR不能赋予csp22响应性的实验一致。最近的一份报告还显示，NbCSPR与RE02相同，RE02是VmE02的受体，VmE0是一种由不同微生物分泌的保守的富含Cys的蛋白质。该研究为分子农业提供了新的机遇，在分子农业中，具有更大生物量的成熟植株现在可以用于有效的瞬时基因表达。NbCORE的更持久的沉默可以通过基因组编辑来实现，或者通过改造根瘤农杆菌菌株来包含不再被NbCORE识别的CSP。这两种方法都将极大地提高本氏烟草成熟植株的瞬时蛋白质产量。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.14037
来源：PBJ植物科学技术
转自：“iPlants”微信公众号
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