NAR | 厦门大学陈洪敏团队成功实现基于G-四链体的CRISPR光开关用于基因组调控的时空控制

CRISPR技术在基因调控和编辑方面具有巨大的应用前景。然而，精确控制CRISPR编辑对于克服其不可控的反应过程和导致脱靶编辑的过度活性至关重要。

2023年3月13日，厦门大学陈洪敏团队在Nucleic Acids Research 上在线发表题为“G-quadruplex-based CRISPR photoswitch for spatiotemporal control of genomic modulation  ”的研究论文，该研究通过嵌入双偶氮苯衍生物（AZD+ +）在G -四链体g RNA ( GqRNA )上设计了一个光开关，用于精确控制基因编辑和表达。结果表明，在crRNA上合理设计G -四链体比未修饰的单向导( sgRNA )具有更高的稳定性和序列识别特异性。

光诱导AZD++异构化快速改变了GqRNA的on状态，有利于快速激活核糖核蛋白活性，对细胞中的on-target位点进行基因组编辑，具有优异的编辑效率。反过来，AZD++-GqRNA迅速复性至关闭状态，抑制基因组切割，限制脱靶效应和副产物的产生。因此，光可逆模式的提出为CRISPR - Cas9的调控提供了新的机会，以提高其安全性和适用性。

微生物适应性免疫系统CRISPR-Cas9在不同的应用中，特别是在基因编辑中，已经成为一种高效和通用的基因组工程工具。在CRISPR - Cas9基因编辑过程中，CRISPR RNA /反式激活CRISPR RNA ( crRNA / tracrRNA )双链或嵌合单链向导RNA ( sgRNA )引导Cas9识别并切割靶位点，其中包含一个前间隔邻近基序( PAM )和gRNA的互补间隔序列。然而，CRISPR编辑技术的效率和安全性仍面临诸多挑战。因此，在细胞中有条件地限制CRISPR复合物的活性将有助于减少脱靶效应。

为了赋予CRISPR - Cas9系统精确的时间控制基因编辑或表达的能力，人们做了很多努力。光的使用由于其非侵入性和高时空分辨率，是CRISPR - Cas9调控的有吸引力的方法之一。目前的光激活策略大多依赖于Cas9核酸酶的改造，因其包括筛选突变和拆分位点，或非天然氨基酸突变而复杂繁琐。作为一种替代方法，sgRNA的修饰因其简化的程序和较高的基因传递效率而特别具有吸引力。基于结构的gRNA改造是一个有趣的主题和用途，例如在gRNA的5′端引入发夹结构或设计用于提高序列识别特异性的反间隔肽核酸。此外，利用gRNA设计的基于G -四链体的基序对细胞核酸酶具有更高的稳定性，在sgRNA或tracr RNA的3 '端设计具有化学敏感性的G -四链体结构被证明可以调节基于CRISPR的基因组调控。

基于G -四链体的CRISPR光开关系统的设计示意图（图源自Nucleic Acids Research ）

依靠gRNA的单一结构改造或化学修饰无法保证CRISPR编辑的时空控制，结构单元或分子可能限制构象灵活性。光诱导sgRNA策略已有报道，包括合成带有紫外光敏接头的抑制性寡核苷酸以阻断gRNA ，以及在gRNA上修饰对光不安的核苷酸以通过时空调控抑制其活性)。然而，考虑到它们的光学刺激模式，这些方法大多是单向的，对CRISPR的开启或关闭状态进行粗略的时间控制，并且是不完整的，不能完全抑制活性。这就要求具有高时间分辨率的转录系统控制能力，因为典型的强力霉素诱导型启动子需要较长时间才能达到最大活性，而不满足时间分辨率要求。因此，迫切需要一种可逆开关实现基因组调控的时空精准控制。

该研究设计并制备了基于G -四链体gRNA ( GqRNA )的结构光开关。化学合成的双偶氮苯衍生物( AZD + + )与GqRNA整合形成AZD++- GqRNA，通过光控可逆异构化实现对CRISPR-Cas9编辑的空间控制。在该设计中，5′端为G -四链体的crRNA完全取消了其切割效率，偶氮苯部分发生反式到顺式异构化，以调节GqRNA开关在UV / VIS光刺激下处于开或关状态。在on状态下，AZD++- GqRNA快速激活核糖核蛋白活性进行基因组编辑并在细胞中表达，而off状态下AZD++- GqRNA快速终止编辑并减少副产物的产生和脱靶效应。

参考信息：

https://doi.org/10.1093/nar/gkad178

转自：“iNature”微信公众号

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